RNASET2分子在白癜風發(fā)病中的作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述：
　　第一部分 應激對人表皮角質形成細胞和黑素細胞RNASET2的表達影響
　　目的:探討白癜風患者皮損區(qū)RNASET2的表達情況;運用改良方法，簡單、經濟地從人包皮組織中分離擴增得到大量高純度原代角質形成細胞(HEKs)和黑素細胞(HEMs);在體外觀察應激因素作用下HEKs和HEMs中RNASET2的表達情況。
　　方法:利用實時PCR和Western blot分析了白癜風皮損處RN

2、ASET2的表達，并用RNASET2的多克隆抗體進行免疫組化研究，以確定白癜風樣品中RNASET2表達情況;根據原代角質形成細胞和黑素細胞對胰酶的不同耐受性和成纖維細胞不能耐受G418的特性可分離出純原代黑素細胞和角質細胞;過量的紫外線照射(NB-UVB)、氧化應激(H2O2)、炎癥(LPS)刺激體外培養(yǎng)的HEKs和HEMs，利用實時PCR，Western blot和免疫熒光檢測技術鑒定HEKs和HEMs在應激作用下RNASET2表達情

3、況。
　　結果:與正常對照組相比較，白癜風患者皮損RNASET2在轉錄（白癜風vs對照組:4.056±1.115 vs1.034±0.166; p＜0.001）和蛋白水平都顯著升高;成功從人包皮組織中分離擴增得到大量高純度HEKs和HEMs;與未處理組比較，HEKs和HEMs在一定應激作用劑量范圍內，RNASET2在轉錄和蛋白表達水平都有明顯升高。
　　結論:白癜風患者皮損處RNASET2顯著增加;白癜風誘發(fā)因素可以使HEK

4、s和HEMs中RNASET2表達增加。
　　第二部分 RNASET2基因產物對原代角質形成細胞和黑素細胞生物學功能的影響
　　目的:探討體外RNASET2過表達對原代培養(yǎng)的角質形成細胞和黑素細胞的生物學功能影響。
　　方法:利用RNASET2過表達慢病毒分別感染原代角質形成細胞和黑素細胞;感染后72h，用熒光顯微鏡觀察鑒定了慢病毒感染細胞的效率;通過Western blot技術對感染結果進行了鑒定;采用CCK-8細胞活

5、性實驗、Annexin V-APC/7-AAD雙色標記法和colony-forming法對RNASET2過表達原代角質形成細胞和黑素細胞的增殖凋亡情況進行了研究;通過將適當濃度的外源性氧化應激因素H2O2加入RNASET2過表達的原代角質形成細胞和黑素細胞中，觀察氧化應激對RNASET2過表達細胞的影響;采用實時PCR、Western blot、黑素含量測定以及酪氨酸酶活性測定等技術檢測RNASET2過表達對黑素細胞合成黑素能力的影響情

6、況。
　　結果:慢病毒成功感染原代角質形成細胞和黑素細胞72h后，感染效率＞90％;與轉染空載體(VECTOR)細胞比較，RNASET2過表達(OE RNASET2)引起原代角質形成細胞(VECTOR vs OE RNASET2:4.167±0.330 vs23.467±1.482;p=0.003)和黑素細胞(VECTOR vs OE RNASET2:5.400±0.455 vs27.333±1.053;p=0.001)的凋亡具有

7、統(tǒng)計學意義;RNASET2過表達使原代角質形成細胞和黑素細胞對氧化應激更敏感;RNASET2過表達導致黑素細胞合成黑素能力下降。
　　結論:RNASET2過表達導致原代角質形成細胞和黑素細胞凋亡;RNASET2過表達導致黑素細胞合成黑素能力下降。
　　第三部分 RNASET2基因產物在白癜風發(fā)病中的機制研究
　　目的:探討RNASET2過表達導致原代角質形成細胞和黑素細胞凋亡和黑素合成下降引發(fā)白癜風的機制。
　　

8、方法:為探討RNASET2的促凋亡作用是否依賴于其催化位點，采用RNASET2催化位點突變后的過表達慢病毒(OE RNASET2-ci)分別轉染原代角質形成細胞和黑素細胞;同時，由于最近研究發(fā)現RNASET2的結構中含有能結合凋亡因子TRAF2的結構域，為證實RNASET2分子中TRAF2結構域是否與RNASET2的促凋亡作用相關，我們將RNASET2的TRAF2結合位點突變后的過表達慢病毒(OE RNASET2-ti)分別轉染原代角質

9、形成細胞和黑素細胞;用熒光顯微鏡觀察鑒定了慢病毒感染細胞的效率;通過Western blot技術對感染結果進行了鑒定;采用CCK-8細胞活性實驗和Annexin V-APC/7-AAD雙色標記法對RNASET2過表達原代角質形成細胞和黑素細胞的增殖凋亡情況進行了研究;為探討RNASET2的促凋亡作用依賴于RNASET2蛋白與TRAF2蛋白的相互結合作用，采用免疫共沉淀(CO-IP)及Western blot技術檢測RNASET2突變前后

10、過表達對細胞凋亡的影響情況。
　　結果:RNASET2催化位點突變后的過表達慢病毒(OE RNASET2-ci)和RNASET2的TRAF2結合位點突變后的過表達慢病毒(OE RNASET2-ti)分別成功感染原代角質形成細胞和黑素細胞，感染效率＞90％; RNASET2基因產物導致細胞凋亡不依賴于其催化位點，而是與凋亡因子TRAF2密切相關;RNASET2通過RNASET2-TRAF2-caspases通路引起細胞凋亡。