腸源性內毒素血癥在NAFLD、T2DM發(fā)病中的作用及其分子機制的研究.pdf

1、近些年來隨著飲食生活方式的改變，以脂肪、糖類（蔗糖或果糖）為代表的高熱量食物和飲料所占比例明顯增加，超重與肥胖者日益增多，脂肪肝、Ⅱ型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)、高血壓及心腦血管疾病等代謝性疾病的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，而非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)作為代謝綜合征(metabolicsyndrome，MS)在肝臟的表現也愈加受到重視?，F已

2、證實NAFLD大多伴有腸源性內毒素血癥(Intestinalendotoxemia，IETM)。我們實驗證實皮下小劑量注射LPS第9周可使大鼠發(fā)生胰島素抵抗(insulinresistance，IR)和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)，結合Cani應用高脂膳食可引起代謝性內毒素血癥，并可誘發(fā)肥胖與胰島素抵抗，使我們聯想IETM是否既可引起慢性低度炎癥又可引發(fā)以IR為基礎的代謝綜合征，

3、在NAFLD、T2DM等代謝綜合征相關疾病的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著啟動作用，因此設計以下實驗來證實我們的觀點。
　　 本論文共分三部分:
　　 第一部分:代謝綜合征及其相關疾病動物模型的建立
　　 第二部分:IETM在MS及相關疾病發(fā)生發(fā)展中的作用的研究
　　 第三部分:IETM啟動MS相關代謝疾病的基本機制
　　 第一部分:通過長期高糖高脂飲食建立代謝綜合征及其相關疾病的動物模型
　　 實

4、驗一大鼠體重及內臟脂肪重量的改變
　　 選取64只雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為8組:3月正常對照組8只(3C)，6月正常對照組8只(6C)，9月正常對照組8只(9C)，12月正常對照組8只(12C)，以正常飲食喂養(yǎng);3月高糖高脂組(3H)8只，6月高糖高脂組(6H)8只，9月高糖高脂組(9H)8只，12月高糖高脂組(12H)8只，采用高糖高脂膳食（70％正常飼料+20％豬油+1O％蔗糖+1％膽固醇+0.25％膽酸）喂養(yǎng)

5、。上述各組動物均在天黑前投食，自由飲水，每月稱體重一次。分別于實驗第3月末、第6月末、第9月末、第12月末于大鼠麻醉狀態(tài)下，稱取體重;量取體長，計算Lee's指數;并于無菌條件下摘取肝臟、內臟脂肪組織（附睪和腎周）稱重，計算肝臟、內臟脂肪與殺鼠前大鼠重量比值。結果:經高糖高脂膳食喂養(yǎng)后，各階段模型組大鼠與正常組大鼠相比，體重、Lee'sindex明顯增加(p＜0.05);肝指數、內臟脂肪占體重百分比明顯增加(p＜0.05)。提示經過高糖

6、高脂飲食喂養(yǎng)可誘發(fā)大鼠發(fā)生超重和肥胖。
　　 實驗二大鼠血漿炎癥介質的變化
　　 上述動物于實驗第3月末、第6月末、第9月末、第12月術觀察血液LPS、TNFa、CRP的改變。結果:經高糖高脂喂養(yǎng)一年的大鼠各階段血漿LPS、TNFa、CRP水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)，提示經高糖高脂喂養(yǎng)大鼠在第3個月時已形成腸源性內毒素血癥和低度炎癥，且持續(xù)增高至第12個月。
　　 實驗三大鼠血脂及肝酶的改變
　

7、　 上述動物于實驗第3月末、第6月末、第9月末、第12月末觀察血液TG、Tch、HDL-c、LDL-c和ALT的改變。結果:經一年高糖高脂喂養(yǎng)模型組大鼠于實驗第三月末已出現高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、異常脂蛋白血癥;肝酶ALT活性明顯升高。
　　 實驗四FPG、FIN、HOMA-IR、HOMA-p及大鼠糖耐量的改變
　　 上述動物于實驗第2月末進行腹腔糖耐量，并于實驗第3月末、第6月末、第9月末、第12月末觀察血液F

8、PG、FINS、HOMA-IR和HOMA-β的改變。結果:大鼠糖耐量明顯降低;FPG、FINS和HOMA-IR的水平都升高，其差異有統(tǒng)計學意義;而HOMA-p以第六個月出現代償性增強后進行性衰退。糖耐量實驗的五次采血均顯示高糖高脂組的血糖水平明顯高于正常對照組，表明大鼠糖耐量明顯降低。
　　 實驗五肝臟、胰腺及脂肪組織的病理改變及肝細胞、胰島β細胞凋亡的觀察
　　 上述動物分別于實驗第3月末、第6月末、第9月末、第12月

9、末于大鼠麻醉狀態(tài)下，摘取肝臟、胰腺和內臟脂肪組織固定于10％中性福爾馬林溶液，石蠟包埋切片，進行HE染色，光鏡下觀察病理學改變。運用TUNEL進行肝細胞、胰島β細胞凋亡的觀察。結果:病理組織學顯示肝臟發(fā)生嚴重的脂變、脂肪肝進而發(fā)生肝炎、纖維化及肝硬化;隨時間進展胰島逐漸萎縮并伴有炎性浸潤;脂肪細胞逐漸增大并伴有炎性浸潤。TUNEL結果顯示高糖高脂組3-12月見到肝細胞、胰島凋亡細胞數量逐漸增加，與正常對照組相比有顯著性差異。
　　

10、 綜合第一部分的實驗結果歸納如下:①高糖高脂喂養(yǎng)一年大鼠出現了肥胖和內臟脂肪的增加，異常脂蛋白血癥，糖耐量減低和空腹血糖升高等代謝綜合征的主要組份;②高糖高脂喂養(yǎng)一年大鼠肝臟發(fā)生嚴重的脂變、脂肪肝進而發(fā)生肝炎、纖維化及肝硬化，符合NAFLD的整個過程;③高糖高脂喂養(yǎng)一年早期大鼠出現IR，后期病理觀察胰島萎縮，TUNEL證實胰島細胞數量逐漸減少導致分泌功能進行性下降最終衰竭走向顯性T2DM。④非酒精性脂肪性肝病與Ⅱ型糖尿病都屬于MS相關

11、的疾病，這一組疾病其本質是慢性低度炎癥性疾病，其共同的基本發(fā)病機制是胰島素抵抗，高糖高脂喂養(yǎng)一年大鼠出現慢性低度炎癥，并且胰島素抵抗指數明顯增加并且始終保持高水平。⑤雖然整個實驗時間過長，但符合臨床實際，可通過漸進過程深入了解其病理過程，是研究代謝綜合征及其相關疾病的成功的動物模型。
　　 第二部分:IETM在MS及相關疾?。∟AFLD與T2DM）發(fā)生發(fā)展中的作用的研究
　　 實驗六IETM誘發(fā)慢性低度炎癥
　　

12、 上述動物于實驗第3月末、第6月末、第9月末、第12月末觀察血液MCP-1的水平，免疫組化方法檢測內臟脂肪組織、肝組織、胰腺組織中CD68的表達情況。結果:經高糖高脂喂養(yǎng)一年的大鼠各階段血漿MCP-1水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)，且持續(xù)增高至第12個月。免疫組化結果顯示各階段高糖高脂組大鼠的脂肪組織、肝組織、胰腺組織CD68表達水平明顯升高，且隨時間推移加重。
　　 實驗七IETM與胰島素抵抗
　　 檢測各階段

13、大鼠肝臟TG含量，并對肝臟TG與IR，LPS與IR進行相關性分析。結果:各階段肝TG含量明顯升高，并且肝TG與IR，LPS與IR呈顯著正相關。
　　 實驗八脂質異地沉積
　　 檢測各階段大鼠血漿FFA的含量，并對肝臟、胰腺進行蘇丹IV染色觀察脂肪沉積情況。結果:經一年高糖高脂喂養(yǎng)模型組大鼠于實驗第三月術FFA水平已明顯升高，至第六個月達到高峰并持續(xù)升高至第十二個月，肝臟、胰腺組織可見程度不等的脂肪沉積。
　　 綜

14、合第二部分的實驗結果，歸納如下:①高糖高脂誘導的非酒精性脂肪性肝病存在腸源性內毒素血癥，并且一直延續(xù)至T2DM的出現。②IETM可以誘發(fā)慢性低度炎癥反應。③IETM通過脂解作用促進肝、胰的異位脂質沉積，影響并決定著IR的發(fā)生。
　　 第三部分:IETM啟動MS相關代謝疾病的基本機制
　　 實驗九氧化應激
　　 檢測各階段大鼠血漿SOD、MDA的水平，并觀察肝臟、胰腺ROS的改變。結果:大鼠血漿SOD水平顯著降低，

15、而MDA水平顯著升高，且LPS與SOD呈負相關，LPS與MDA呈正相關;肝臟的ROS含量于實驗第三個月開始升高，而胰腺的ROS含量于實驗第六個月開始升高，并且持續(xù)升高至實驗第十二個月，這些結果提示氧化應激的存在。
　　 實驗十內質網應激
　　 采用Westernblotting測定肝組織、胰腺組織中JNKI、p-JNKI、NFKBp65、IKB、GRP78蛋白表達水平。結果:各階段高糖高脂組的大鼠肝組織p-J-NKI、N

16、F-KBp65、GRP78表達顯著高于正常組，而I-KB表達顯著低于正常組;高糖高脂組的大鼠胰腺組織p-JNK1、NF-KBp65的表達于第六個月開始升高，第九個月、第十二個月達到高峰，而I-κB的表達也于第六個月開始降低。模型組GRP78的表達自第三個月開始增強，于第九個月升至最高且持續(xù)至第十二個月保持較高水平，與對照組差異明顯。這些結果提示肝臟、胰腺均發(fā)生了內質網應激。
　　 綜合第三部分的實驗結果，歸納如下:①模型組大鼠血

17、漿中MDA水平增加而抗氧化酶SOD的水平減少，并且MDA的改變與LPS呈顯著正相關，SOD的改變與LPS呈顯著負相關;同時肝臟和胰腺的ROS水平有不同程度的增加，進一步支持LPS可通過誘發(fā)氧化應激參與NAFLD、T2DM等MS相關疾病的發(fā)生發(fā)展。②血中LPS升高水平與肝臟、胰島P-JNK、NF-κB和GRP78走向大體一致，LPS可能通過肝臟和胰島浸潤的單核巨噬細胞，誘發(fā)內質網應激，使GRP78從跨膜蛋白脫落入血，使p-JNK和NF-κ

18、B信號蛋白表達增加。
　　 綜上所述，本研究得出以下結論:
　　 1.高糖高脂膳食喂養(yǎng)大鼠可以成功復制和人類臨床實際更為接近的代謝綜合征及其相關疾病的模型。
　　 2.高糖高脂所致的非酒精性脂肪性肝病伴有腸源性內毒素血癥，并且一直延續(xù)達一年之久。
　　 3.IETM可以誘發(fā)慢性低度炎癥與胰島素抵抗，并可以通過脂解作用引起脂質異地沉積，使肝細胞蓄積大量TG、炎癥并伴有纖維化;使胰島p細胞發(fā)生IR、炎癥、胰島