腸源性內(nèi)毒素血癥在脂肪性肝病中對(duì)胰島素抵抗的影響.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是指肝組織病理學(xué)改變與酒精性肝病相類似，但無(wú)過(guò)量飲酒史的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝纖維化和肝硬化三種病理類型。NAFLD由于發(fā)病率逐年攀升而起病漸趨低齡化，已日益成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。 然而迄今為止它的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前公認(rèn)的理論是“二次打擊學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為胰島素抵抗(insulinresista

2、nce，IR)參與肝臟形成單純性脂肪肝的第一次打擊，并通過(guò)氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)肝臟進(jìn)行第二次打擊，導(dǎo)致脂肪性肝炎的發(fā)生并進(jìn)一步發(fā)展。目前已有足夠的證據(jù)表明腸源性內(nèi)毒素血癥(intestinalendotoxemia，IETM)在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。為了探討IETM與IR在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制以及二者之間的關(guān)系，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分三個(gè)部分： 第一部分，腸源性內(nèi)毒素血癥合并胰島素抵抗的非酒

3、精性脂肪肝大鼠模型的建立。 實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)二采用含20％玉米油的飼料喂養(yǎng)大鼠。從8周末開(kāi)始大鼠的體重、肝指數(shù)、肝組織TG和Tch、血漿ALT、ET已經(jīng)有明顯升高；12周末開(kāi)始出現(xiàn)HA的增高：14周末胰島素抵抗指數(shù)明顯升高。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察得出結(jié)論：模型大鼠8周末至10周末形成了單純性脂肪肝，12周末至14周末發(fā)展為脂肪性肝炎，16周末發(fā)展為脂肪性肝纖維化。14周末形成IETM合并IR的非酒精性脂肪肝大鼠模型。而以甘氨酸干預(yù)后各項(xiàng)指標(biāo)

4、均比16周組減輕，提示隨著IETM的減輕，IR亦隨之改善，NAFLD得到了有效控制，在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中IETM與IR之間有密切關(guān)系。 第二部分，脂多糖對(duì)脂肪細(xì)胞及肝細(xì)胞胰島素抵抗的影響。 實(shí)驗(yàn)三以油紅染色證實(shí)以特異性誘導(dǎo)劑8天后3T3-L1脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞；觀察培養(yǎng)液的糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)水平，葡萄糖攝取以及IRS-1mRNlA與PPARγmRNA的表達(dá)，結(jié)果提示以高濃度TNFα(20ng

5、/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，可成功復(fù)制出胰島素抵抗模型；在此基礎(chǔ)上，以具有抑制內(nèi)毒素血癥的甘氨酸干預(yù)，并以胰島素增敏劑羅格列酮作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞的IR得到了有效控制，進(jìn)一步證實(shí)了實(shí)驗(yàn)二動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，即IETM與IR之間有密切關(guān)系，并可能在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。而且，Gly對(duì)NAFLD的防治作用，很可能是通過(guò)拮抗內(nèi)毒素血癥而控制脂肪組織的IR來(lái)發(fā)揮作用的。 實(shí)驗(yàn)四運(yùn)用脂多糖處理后的脂肪細(xì)胞糖、胰島素和胰島素抵

6、抗指數(shù)水平均有不同程度的增高，兩種狀態(tài)下的葡萄糖攝取和IRS-1mRNA與PPARγmRNA表達(dá)的相對(duì)含量均有不同程度的降低，其中少量多次LPS組的胰島素抵抗結(jié)果更接近于TNFα組。結(jié)果提示，少量多次給予LPS模擬了體內(nèi)IETM的作用形式，刺激脂肪細(xì)胞可以產(chǎn)生類似高濃度TNFα的效果，誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞發(fā)生IR。 實(shí)驗(yàn)五、六培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，觀察各組培養(yǎng)液的糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)水平，葡萄糖攝取、糖原含量，PAS染色觀察糖原顆粒

7、，結(jié)果提示以高濃度(5×10-7mol/L)的胰島素作用于HepG2細(xì)胞24h后可成功復(fù)制胰島素抵抗模型，胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)從24h開(kāi)始持續(xù)到48h；以甘氨酸干預(yù)發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞的IR得到了一定的控制，進(jìn)一步反證了第一、二部分實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，即IETM與IR之間有密切關(guān)系，并可能在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；當(dāng)模擬體內(nèi)IETM形成的特點(diǎn)，少量多次給予LPS和與實(shí)驗(yàn)三誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞IR同等劑量的TNFα直接作用于肝細(xì)胞，對(duì)HepG2細(xì)胞IR

8、的發(fā)生作用并不明顯，而當(dāng)以上刺激作用于同時(shí)給予高胰島素刺激產(chǎn)生IR的HepG2細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞發(fā)生的IR比單純高胰島素刺激更為強(qiáng)烈，提示在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中，IETM可能與IR互為因果并形成惡性循環(huán)，對(duì)肝細(xì)胞IR有促進(jìn)作用。 第三部分，腸源性內(nèi)毒素血癥與胰島素抵抗在非酒精性脂肪性肝病發(fā)病中關(guān)系的研究。 實(shí)驗(yàn)七、八，以高不飽和脂肪酸、高飽和脂肪酸及高糖高脂飲食分別喂養(yǎng)大鼠9周，觀察各模型組大鼠各周體重曲線、肝指數(shù)、血清與肝

9、組織勻漿中TG、血漿FFA含量、ALT活性、空腹血糖、FINS和FIRI、組織學(xué)檢查、肝脂變結(jié)果、炎癥活動(dòng)度計(jì)分、蘇丹Ⅳ染色并進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，結(jié)果表明4周末隨機(jī)抽查活檢的三組模型組大鼠肝臟已呈明顯的氣球樣變，輕度脂肪變；9周末大鼠分別形成了單純性脂肪肝及脂肪性肝炎，同時(shí)合并腸源性內(nèi)毒素血癥與胰島素抵抗。各模型組共同特點(diǎn)是腹部脂肪豐富，脂肪體積肥大，周圍巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，脂肪細(xì)胞TNFα強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)且以上表現(xiàn)隨NAFLD的發(fā)展依次加強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)提

10、示三種膳食均可建立伴有IEETM、IR的NAFLD的動(dòng)物模型，不同的內(nèi)毒素水平影響了IR并進(jìn)一步影響NAFLD的嚴(yán)重程度。腹部脂肪及其間質(zhì)中以巨噬細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是NAFLD發(fā)病中TNFα的起始來(lái)源。 綜上得出結(jié)論：在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，IR做為NAFLD的始動(dòng)環(huán)節(jié)，IETM則是不可或缺的觸發(fā)因子，二者以TNFα為紐帶，并互相作用、互為因果，伴隨NAFLD發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程。 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，得出以下結(jié)論:

11、 1、高不飽和脂肪酸、高飽和脂肪酸與高糖高脂膳食均可建立伴有腸源性內(nèi)毒素血癥、胰島素抵抗的非酒精性脂肪性肝病的動(dòng)物模型。 2、脂多糖可在體外培養(yǎng)的3T3-L1脂肪細(xì)胞與HepG2肝細(xì)胞中誘發(fā)胰島素抵抗。 3、脂多糖可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞(包括脂肪細(xì)胞)釋放TNFα等細(xì)胞因子，使之不但引起胰島素抵抗，同時(shí)加劇氧應(yīng)激。故脂多糖是非酒精性脂肪性肝病的觸發(fā)因子。 4、本研究證實(shí)甘氨酸可以通過(guò)拮抗內(nèi)毒素控制脂肪肝的發(fā)生發(fā)展，為