NOX4在人血管細胞中的表達及其在內(nèi)皮細胞凋亡中的作用.pdf

1、活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)是調(diào)節(jié)血管功能狀態(tài)的重要信號分子。業(yè)已證明，ROS可通過引起血管內(nèi)皮細胞氧化損傷而在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中起重要作用。雖然黃嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶(NOX)、線粒體電子傳遞鏈及一氧化氮合酶等均可產(chǎn)生ROS，但人血管系統(tǒng)中產(chǎn)生的ROS主要來源于NOX。最早在吞噬細胞中發(fā)現(xiàn)的NOX為gp91phox，近年來，在不同組織中如結(jié)腸、腎臟、脾臟及血管平滑肌細胞中，發(fā)現(xiàn)了新的gp91

2、phox(現(xiàn)亦稱為NOX2)同工酶，分別為NOX1、NOX3、NOX4和NOX5。最新研究提示NOX4可能作為血管內(nèi)皮細胞中主要的NOX參與內(nèi)皮細胞內(nèi)ROS的生成。本研究首先用RT-PCR檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)、內(nèi)皮細胞株(ECV304和HU-LT)和人臍動脈平滑肌細胞(humanumbilicalarterysmoothmusclecells，HUAS

3、MCs)中NOX基因的表達，結(jié)果證實NOX4是人內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中表達的主要NOX。在此基礎(chǔ)上，觀察HUVECs在高葡萄糖、高濃度低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，LDL)、無血清和高血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)等培養(yǎng)條件下NOX4mRNA、ROS水平和細胞凋亡的變化，分析NOX4表達與ROS生成之間的關(guān)系，進一步明確NOX4是否通過產(chǎn)生ROS參與內(nèi)皮細胞損傷?！　〉谝徊糠指咂咸烟堑?/p>

4、對人內(nèi)皮細胞NOX4表達、ROS水平、和凋亡的影響 目的:分析人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人臍動脈平滑肌細胞中的NOX表達；研究在高葡萄糖、高LDL、無血清和高AngⅡ刺激HUVECs時細胞內(nèi)ROS、NOX4mRNA水平和凋亡的變化。方法:倒置顯微鏡下觀察人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人臍動脈平滑肌細胞形態(tài)；用免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞Ⅷ因子相關(guān)抗原的表達，用免疫組化法檢測人臍動脈平滑肌細胞α-肌動蛋白的表達；以NOX1cDNA表

5、達質(zhì)粒(NOX1-pcDNA3.1)、人髓系白血病細胞株U937、人肝癌細胞株HepG2和NOX4cDNA表達質(zhì)粒(NOX4-pcDNA3.1)分別作為檢測NOX1、NOX2、NOX3和NOX4mRNA表達的陽性對照，用RT-PCR檢測HUVECs、HUASMCs、ECV304和HU-LT中NOX的表達；在高葡萄糖、高LDL、無血清和高AngⅡ刺激HUVECs時用RT-PCR檢測NOX4mRNA水平，以DCFH-DA為熒光探針用流式細胞

6、儀檢測各組細胞內(nèi)ROS生成量，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Hoechst染色分析細胞凋亡。結(jié)果:HUVECs中Ⅷ因子相關(guān)抗原表達為陽性，HUASMCs中α-肌動蛋白表達為陽性；HUVECs中表達NOX4mRNA和NOX2mRNA，HU-LT和HUASMCs主要表達NOX4mRNA，但ECV304中不表達NOX；高葡萄糖、高LDL、無血清和高AngⅡ刺激HUVECs時，NOX4mRNA表達上調(diào)，細胞內(nèi)ROS生成增加，細胞凋亡增加。結(jié)論:(

7、1)人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人臍動脈平滑肌細胞主要表達NOX中的NOX4；(2)高葡萄糖、高LDL、無血清和高AngⅡ促進NOX4mRNA表達的同時，細胞內(nèi)ROS生成和凋亡增加。　　第二部分高水平NOX4表達對人內(nèi)皮細胞凋亡的影響 目的:研究NOX4表達水平的改變對內(nèi)皮細胞ROS生成和凋亡的影響。方法:用脂質(zhì)體試劑盒轉(zhuǎn)染NOX4表達質(zhì)?；騁FP表達質(zhì)粒到人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs和ECV304)中，用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染NOX4

8、和GFP表達質(zhì)粒后NOX4mRNA的表達水平，用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS的變化，用Hoechst染色和TUNEL法觀察細胞凋亡，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NOX4表達質(zhì)粒后的HUVECs中NOX4mRNA表達明顯高于轉(zhuǎn)染GFP表達質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對照組，轉(zhuǎn)染NOX4表達質(zhì)粒的ECV304組亦表達NOX4mRNA；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染GFP表達質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對照組相比，轉(zhuǎn)染NOX4表