CCR2在MCP-1誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：研究趨化因子受體2（CCR2）在單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（CRL-1730）凋亡中的作用并初步探討蛋白激酶C（PKC）信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)MCP-1誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。 方法：第一部分：培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；用不同濃度單核細(xì)胞趨化蛋白-1（0．1ng/ml，1．0ng/ml，10ng/ml，100ng/ml）對(duì)其作用24h后，Western blot法檢測(cè)CCR2蛋白表達(dá)量的變化

2、；設(shè)計(jì)CCR2正義寡核苷酸鏈、反義寡核苷酸鏈及與人類基因非同源性的寡核苷酸序列，運(yùn)用反義寡核苷酸技術(shù)以脂質(zhì)體為載體將CCR2正義寡核苷酸鏈、反義寡核苷酸鏈及與人類基因非同源性的寡核苷酸序列轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MCP-1誘導(dǎo)的CCR2蛋白的表達(dá)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。第二部分：加入CCR2的阻斷劑RS102895后，用MCP-1作用細(xì)胞，激光掃描共聚焦顯微鏡原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Annexin V-FI

3、TC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)觀察加入不同劑量RS102895后MCP-1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。第三部分：用不同濃度的PKC激動(dòng)劑PMA與PKC抑制劑chelerythrine分別作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，再用10ng/ml的MCP-1誘導(dǎo)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株經(jīng)免疫熒光鑒定Ⅷ抗體陽(yáng)性，證明為內(nèi)皮細(xì)胞；MCP-1（0．1ng/ml，1．0 ng/ml，10 ng/ml，100 ng/ml）能誘導(dǎo)人臍靜脈

4、內(nèi)皮細(xì)胞中受體CCR2蛋白的表達(dá)，其效應(yīng)隨濃度的增加而增加；熒光倒置顯微鏡與流式細(xì)胞術(shù)確定0．4μg/μl FITC標(biāo)記的CCR2反義寡核苷酸作用CRL-1730細(xì)胞48h為最佳轉(zhuǎn)染效率；CCR2反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后可明顯抑制CCR2蛋白表達(dá)（P<0．05），對(duì)MCP-1誘導(dǎo)的hUVECs凋亡有明顯抑制作用。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到加入CCR2阻斷劑組比只加入MCP-1作用組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)加入CCR2阻斷劑對(duì)MCP

5、-1誘導(dǎo)的CRL-1730細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，并隨RS102895劑量的增加細(xì)胞的凋亡率逐漸降低（P<0．01，P<0．01，P<0．01）．不同濃度的PMA（1×10-4mmol/L、1×10-3mmol/L）能增強(qiáng)MCP-1誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，凋亡效應(yīng)隨劑量增加而增強(qiáng)（P<0．05，P<0．01）。不同濃度的PKC抑制劑chelerythrine并非都能抑制MCP-1誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，在抑制劑濃度為1×10-