VPO1在冠心病血漿中的變化及其在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用與機制研究.pdf

1、尋找活性氧(ROS)的來源從而清除ROS是目前防治動脈粥樣硬化(AS)的重要措施之一。已知髓過氧化物酶(MPO)能催化過氧化氫成為次氯酸(強氧化劑),是參與AS形成的重要酶類。新近發(fā)現(xiàn)的一種新的過氧化物酶一血管過氧化物酶(VPO)是MPO的一種同工酶,與MPO只存在于中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞中不同,VPO主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,與MPO具有相似的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)活性,提示VPO可能與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　

2、 因此本項目擬在冠心病患者中探討血漿VPO1的水平變化及相關(guān)性,并從分子細(xì)胞水平,運用轉(zhuǎn)染VPO1 shRNA等分子生物學(xué)技術(shù),進一步探討VPO1在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用及其機制。本項目有助于闡明VPO1的致AS作用,為AS的防治提供新的理論依據(jù)。
　　 第一部分、冠心病患者血漿VPO1變化及相關(guān)性研究
　　 目的:本研究旨在觀察冠心病患者血漿中血管過氧化物酶(VPO1)的變化并探討其與冠心病的相關(guān)性。
　　 方

3、法:共納入221名冠心病(CAD)患者及60名健康體檢者,所有研究對象分為三組,急性冠脈綜合征組(ACS)118名,穩(wěn)定型心絞痛組(SAP)103名和正常對照組(Control)60名。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA法)和Western-blot法檢測血漿中VPO1和MPO濃度及蛋白表達;采用透射比濁法檢測血清hs CRP水平;采用ELISA法檢測血漿中氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)水平。比較不同類型冠心病及正常對照組血漿中VPO1,M

4、PO,hs CRP和ox-LDL含量變化,進行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:
　　 (1)ACS組和SAP組患者血漿中VPO1和ox-LDL水平顯著高于正常對照組(P＜0.01),且ACS組顯著高于SAP組,差異具有顯著性(P＜0.01):
　　 (2)hs CRP和MPO在ACS組但均高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),但SAP組和正常對照組濃度差異無顯著性(P＞0.05);
　　 (3)冠心

5、病(ACS組+SAP組)患者血漿中VPO1與ox-LDL呈顯著正相關(guān),與MPO,hs CRP無相關(guān)。
　　 結(jié)論：:冠心病患者血漿VPO1濃度顯著升高,可能與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 第二部分、VPO1在ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用及機制探討
　　 目的:從分子絀胞水平,運用轉(zhuǎn)染VPO1shRNA等分子生物學(xué)技術(shù),系統(tǒng)探討VPO1在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用及其機制。
　　 方法:實驗分為三個部分。

6、
　　 (1)研究ox-LDL對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和VPO1蛋白表達的影響。采用Hochest染色和流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;采用Western-blot法檢測VPO1蛋白表達。分組如下:量效實驗:隨機將培養(yǎng)的6孔板細(xì)胞分為4組:對照組和不同濃度的ox-LDL組(用含50μg/ml,100μg/m1,200μ/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24 h);時效實驗:隨機將培養(yǎng)的6孔板細(xì)胞分為8組:不同時間的對照組(不加任何干預(yù)因

7、素,用培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞0,12,24,48 h)和ox-LDL組(用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞0,12,24,48小時),檢測內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和VPO1蛋白表達;
　　 (2)研究VPO1基因沉默后對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活性氧、HOCl及p38MAPK蛋白的影響。分組如下:隨機將培養(yǎng)的6孔板細(xì)胞分為6組:空白對照組:用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;ox-LDL組:用含100μg

8、/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+apocynin組:加入終濃度為600μM的apocynin(NADPH酶的特異性阻斷劑)孵育細(xì)胞1 h后,加入100μg/mlox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+VPO1 sh RNA組:在成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默VPO1的細(xì)胞模型中,用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;VPO1sh RNA組:在成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默VPO1的細(xì)胞模型中,用含1％小牛血清的DM

9、EM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;apocynin組:加入終濃度為600μM的apocynin(NADPH酶的特異性阻斷劑)孵育細(xì)胞1 h后,用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;采用比色法檢測活性氧,采用熒光法測定HOCl,采用Western-blot法檢測NADPH gp91phox,p38MAPK和VPO1蛋白表達
　　 (3)研究VPO1基因沉默后對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和caspase-3活性的影

10、響。分組如下:隨機將培養(yǎng)的6孔板細(xì)胞分為8組:空白對照組:用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;ox-LDL組:用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+apocynin組:加入終濃度為600μM的apocynin(NADPH酶的特異性阻斷劑)孵育細(xì)胞1 h后,加入100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+VPO1 sh RNA組:在成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默VPO1的細(xì)胞模型巾,用含1

11、00μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+SB203580組:加入終濃度為1μM的SB203580(p38MAPKs的特異性阻斷劑)孵育細(xì)胞1 h后,加入100μg/mlox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+DEVD-CHO組:加入終濃度為100μM的DEVD-CHO(caspase-3的特異性阻斷劑)孵育細(xì)胞1 h后,加入100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;VPO1 sh RNA組:在成

12、功構(gòu)建穩(wěn)定沉默VPO1的細(xì)胞模型中,用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;apocynin組:加入終濃度為600μM的apocynin(NADPH酶的特異性阻斷劑)孵育細(xì)胞1 h后,用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;采用比色法檢測細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性,采用流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮絀胞凋亡。
　　 結(jié)果:
　　 (1)ox-LDL呈濃度和時間依賴性地增加Hoechst陽性細(xì)胞數(shù),增加內(nèi)

13、皮細(xì)胞凋亡率(P＜0.01),促進內(nèi)皮細(xì)胞VPO1蛋白表達。
　　 (2)與對照組相比,ox-LDL(100μg/ml)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24 h顯著升高內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P＜O.01),VPO1基因沉默后或加入NADPH氧化酶抑制劑apocynin(600μM)預(yù)處理1h后,可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成、NADPH gp91phox、VPO1、p38MAPK蛋白表達及HOCl生成。
　　 (3)與對照組

14、相比,ox-LDL(100μg/ml)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24 h顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率(P＜0.01),VPO1基因沉默,加入NADPH氧化酶抑制劑apocynin(600μM),SB203580(1μM),或DEVD-CHO(100μM)預(yù)處理1h后,可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和caspase-3活性升高(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)首次證實ox-LDL可呈濃度和時間依賴性地增加內(nèi)皮細(xì)胞VPO