氧化應(yīng)激在穩(wěn)定性冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞變化中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心病）嚴(yán)重危害人類健康，被稱為“人類健康第一殺手”，在我國也不例外，近年來已成為我國居民的主要致死病因之一。冠心病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制十分復(fù)雜，近年的研究表明內(nèi)皮功能障礙在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。內(nèi)皮功能障礙的本質(zhì)是內(nèi)皮損傷和修復(fù)之間動態(tài)平衡的破壞，而內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)在內(nèi)皮損傷后的修復(fù)中起重要作用。EPCs參與缺血組織的血管新生、促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)、維持內(nèi)皮功能完整。近年的研究表明氧化應(yīng)激

2、對于EPCs的功能具有重要作用。氧化應(yīng)激是指活性氧族(ROS)產(chǎn)生過多或發(fā)生代謝障礙并超過內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)對其的消除能力時，反應(yīng)性氧化物包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫(H2O2)和羥基產(chǎn)物（-OH），通過與DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相互作用，產(chǎn)生過多的損傷的DNA堿基、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，并導(dǎo)致溶酶體、線粒體的損傷。研究表明氧化應(yīng)激使EPCs動員減少，削弱EPCs的粘附、增殖、遷移能力，促進(jìn)EPCs的衰老，誘導(dǎo)其凋亡。研究

3、還表明在內(nèi)皮細(xì)胞和干/祖細(xì)胞，ROS主要來自NADPH氧化酶。NADPH氧化酶是ROS主要調(diào)控酶，可以作為氧化應(yīng)激狀態(tài)的一個指標(biāo)，但是氧化應(yīng)激在穩(wěn)定性冠心病患者EPCs數(shù)量和功能變化中的作用目前尚不清楚。
　　此外，NADPH氧化酶的激活需要胞質(zhì)亞單位和細(xì)胞膜上的p22phox、 gp91phox(Nox2)亞單位的結(jié)合。胞質(zhì)亞單位的磷酸化及隨后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜是NADPH氧化酶活化的關(guān)鍵步驟。許多研究已經(jīng)證實了PKC在其中扮演了重要

4、的角色。NADPH氧化酶的激活可以促進(jìn)P38MAPK和ERK1/2磷酸化，P38MAPK磷酸化可以導(dǎo)致EPCs數(shù)量下降、功能受損和細(xì)胞老化，ERK1/2的激活跟EPCs的遷移有關(guān)，而ERK2的激活跟EPCs粘附功能有關(guān)。NADPH氧化酶的激活還可以促進(jìn)Akt的磷酸化，而PI3K/Akt/eNOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在EPCs功能和衰老的調(diào)控中扮演重要的角色，我們在先前的研究中也證實SDF-1、胸腺素β4、同型半胱氨酸、尼古丁及葛根素等均通過PI

5、3K/Akt/eNOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響EPCs功能和衰老。
　　基于上述理論基礎(chǔ)，我們提出假設(shè):(1)冠心病患者EPCs功能受損與氧化應(yīng)激密切相關(guān);(2) PKC在冠心病患者EPCs內(nèi)NADPH氧化酶激活中起重要作用;(3) NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過PI3K/Akt/eNOS、ERK和P38MAPK信號途徑影響EPCs功能和細(xì)胞衰老。以下是研究假設(shè)圖:
　　1.穩(wěn)定性冠心病內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高，功能受損

6、>　　目的:
　　觀察穩(wěn)定型冠心病內(nèi)皮祖細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，評價EPCs的抗氧化能力、旁分泌和在體血管生成能力。
　　方法:
　　入選性別、年齡基本匹配的20例非糖尿病的穩(wěn)定性冠心病患者和20例非冠心病和糖尿病患者，收集、培養(yǎng)冠心病和對照組的外周血，采用密度梯度離心法獲取單個核細(xì)胞，接種于人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)2-3周后，獲得晚期EPCs。雙染和流式鑒定后用熒光探針法檢測ROS濃度，硫代巴比妥酸(TBA)法檢

7、測脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA濃度，光澤精法檢測NADPH酶活性;然后用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后收集蛋白，分別用各試劑盒檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性，過氧化氫酶(CAT)活力和胞內(nèi)一氧化氨(NO)濃度。采用定量RT-PCR和western blot檢測EPCs內(nèi)Gpx、Cu/Zn SOD和MnSOD的mRNA和蛋白表達(dá)情況。ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)中VEGF、 IL-8、SDF-1、HGF的水平。另外，通過建立大鼠下肢缺血模型EPCs移植評估冠心病

8、EPCs的在體血管生成能力。
　　結(jié)果:
　　穩(wěn)定型冠心病患者與正常對照相比，EPCs內(nèi)ROS水平和MDA水平明顯升高，NADPH氧化酶活性增加，EPCs分泌VEGF、IL-8、SDF-1降低，抗氧化酶系統(tǒng)中SOD和CAT活性增加，胞內(nèi)NO濃度增加，轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提示冠心病患者EPCs內(nèi)Gpx和MnSOD的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，Cu/znSOD則無顯著差異。大鼠下肢缺血模型試驗提示冠心病患者EPCs較正常對照組在體成

9、血管能力減弱。
　　結(jié)論:
　　穩(wěn)定型冠心病患者EPCs內(nèi)NADPH氧化酶激活，氧化應(yīng)激水平增高，抗氧化酶活性降低，旁分泌功能和在體成血管能力減弱。
　　2.穩(wěn)定型冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶的激活機(jī)制
　　目的:
　　觀察和探討穩(wěn)定型冠心病患者EPCs內(nèi)NADPH氧化酶激活的過程及機(jī)制。
　　方法:
　　培養(yǎng)、收集冠心病和對照組的EPCs，分別采用qPCR和western blot檢

10、測EPCs內(nèi)NADPH氧化酶p22phox、p47phox、gp91phox和Nox4亞單位mRNA和蛋白的表達(dá)，然后采用免疫沉淀法檢測EPCs內(nèi)p47phox與Nox2或其同源物Nox4結(jié)合情況，細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)一步檢測EPCs內(nèi)p47phox膜轉(zhuǎn)位情況。最后采用western blot檢測冠心病和正常對照組EPCs內(nèi)PKCα，PKCβ1/2同工酶的表達(dá)差異，以及用PKC抑制劑G(O)6983抑制PKC活性后，EPCs內(nèi)NADPH氧化

11、酶活性和ROS水平的變化，NADPH氧化酶各亞基的表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:
　　穩(wěn)定型冠心病患者EPCs內(nèi)，NADPH氧化酶亞基p47phox、p22phox、gp91 phox以及Nox4的表達(dá)上調(diào)。免疫沉淀和細(xì)胞免疫熒光檢測提示p47phox亞單位發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，并與胞膜亞單位Nox4結(jié)合的比例增加。此外，冠心病EPCs內(nèi)PKCα，PKCβ2的磷酸化增強(qiáng)，PKCβ1則無明顯變化。當(dāng)PKC活性被抑制后，NADPH氧化酶活性

12、和ROS產(chǎn)生減少，gp91phox、p22phox、p47phox、Nox4表達(dá)減少。
　　結(jié)論:
　　穩(wěn)定型冠心病患者EPCs內(nèi)NADPH氧化酶各亞基表達(dá)上調(diào)，并通過p47phox轉(zhuǎn)位至胞膜與Nox4亞單位結(jié)合而激活，其中PKCα/β2信號途徑可能參與激活。
　　3.NADPH氧化酶影響冠心病患者EPCs功能和細(xì)胞衰老的可能機(jī)制
　　目的:
　　探討NADPH氧化酶影響冠心病患者EPCs遷移、粘附和細(xì)胞衰

13、老的可能機(jī)制。
　　方法:
　　培養(yǎng)、收集冠心病和對照組的EPCs，采用western blot檢測EPCs內(nèi)Akt、eNOS、ERK和P38MAPK的表達(dá)及其磷酸化水平，改良的Boyden小室法和細(xì)胞粘附試驗檢測細(xì)胞遷移和粘附功能，SA-β-半乳糖苷酶染色法檢測EPCs衰老。然后采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和夾竹桃麻素(apocynin)抑制NADPH氧化酶以及siRNA干擾技術(shù)抑制NADPH氧化酶p47phox

14、，Nox2，Nox4亞單位，檢測抑制后EPCs內(nèi)NADPH氧化酶活性，ROS水平和NO活性，Akt、eNOS、ERK和P38MAPK的表達(dá)及其磷酸化水平，以及EPCs的遷移，粘附和衰老的變化。最后，采用通路抑制劑SB203580，PD98059，LY294002，L-NAME等，觀察各信號通路在冠心病患者EPCs內(nèi)遷移、粘附和細(xì)胞衰老中的作用。
　　結(jié)果:
　　NAC和apocynin及各亞基siRNA分別抑制冠心病患者EP

15、Cs的NADPH氧化酶活性、ROS活性和NO濃度。穩(wěn)定型冠心病患者EPCs內(nèi)Akt、eNOS、ERK和P38MAPK的磷酸化減弱，遷移和粘附能力減弱，衰老加快。抑制NADPH氧化酶后上述作用逆轉(zhuǎn)，且不同亞基分別對不同的通路和功能起作用。
　　結(jié)論:
　　穩(wěn)定型冠心病患者EPCs中，NADPH氧化酶的激活對P38MAPK、ERK和PI3K/Akt/eNOS信號通路的激活有重要的調(diào)節(jié)作用，NADPH氧化酶在冠心病EPCs內(nèi)可能通