人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來源的exosomes預(yù)防順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:建立人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來源的exosomes(hucMSC-Ex)預(yù)防順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷模型，評價其對順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的預(yù)防保護(hù)作用。通過對自噬相關(guān)分子的分析檢測，探討細(xì)胞自噬作用在其中發(fā)揮的重要作用，并初步闡明hucMSC-Ex預(yù)防順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的相關(guān)分子作用機(jī)制。
　　方法:收集無血清培養(yǎng)的人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(hucMSCs)和人成纖維細(xì)胞(HFL1)的培養(yǎng)上清，以ExoQuick-TCTM試劑

2、盒分離純化兩種細(xì)胞來源的exosomes。透射電子顯微鏡和Nanosight納米顆粒示蹤技術(shù)觀察exosomes的形態(tài)大小，免疫膠體金技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測其生物學(xué)標(biāo)記。構(gòu)建hucMSC-Ex預(yù)防順鉑誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）損傷模型，分組設(shè)置為:正常對照（Normal）組、Cisp+PBS組、Cisp+hucMSC-Ex組和Cisp+HFL1-Ex組。預(yù)先加入hucMSC-Ex處理，然后經(jīng)順鉑誘導(dǎo)處

3、理16h后收集細(xì)胞標(biāo)本;Western Blot，TUN EL，免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)以及MTT等技術(shù)分別檢測HK-2細(xì)胞的增殖、凋亡和自噬等相關(guān)指標(biāo)。提取細(xì)胞RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并利用qRT-PCR技術(shù)檢測HK-2細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá)情況。提取exosomes中的miRNAs，并利用qRT-PCR技術(shù)檢測hucMSC-Ex和HFL1-Ex中的miRNAs;同時提取hucMSC-Ex預(yù)處理的于不同時間點(diǎn)經(jīng)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的m

4、iRNAs，檢測其中miR-155的表達(dá)。
　　結(jié)果:透射電子顯微鏡和Nanosight分析發(fā)現(xiàn)分離純化的hucMSC-Ex呈圓形，免疫電鏡、流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測CD9、CD81、CD63以及CD44等exosomes相關(guān)標(biāo)記蛋白。HK-2細(xì)胞經(jīng)順鉑處理后，細(xì)胞形態(tài)由圓形或橢圓形變?yōu)槔w維狀或梭形;同時凋亡蛋白Bax的表達(dá)在一定范圍內(nèi)隨著順鉑濃度以及作用時間的增加而增加。hucMSC-Ex預(yù)處理HK-2細(xì)胞后，結(jié)

5、果顯示hucMSC-Ex能促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖蛋白PCNA的表達(dá)，細(xì)胞增殖能力有所增強(qiáng);促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2以及細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá);抑制HK-2細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目增多;同時也促進(jìn)了PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白PI3K和AKT蛋白的表達(dá);相應(yīng)地，hucMSC-Ex頇處理HK-2細(xì)胞后，細(xì)胞自噬相關(guān)基因ATG5和ATG7的表達(dá)上調(diào)，自噬相關(guān)蛋白LC-3B和Becli

6、n1的表達(dá)增強(qiáng);然而自噬內(nèi)源性抑制分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）的活化卻受到相應(yīng)的抑制，而HFL1-Ex預(yù)處理后則無明顯的上述作用。QRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex和HFL1-Ex表達(dá)miR-99a-5p和miR-155。順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞后，miR-155在四個時間組中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而hucMSC-Ex預(yù)處理后，miR-155在4h時表達(dá)明顯上調(diào)。