人臍帶間質干細胞來源exosomes分離鑒定及其對細胞生長的影響.pdf

1、目的：
　　 分離培養(yǎng)人臍帶間質干細胞(human umbilical cordmesenchyrmal stem cells,hucMSCs),建立hucMSCs來源的外切體(hucMSCs-exosomes)分離純化方法,鑒定并初步分析其生物學特性;體外研究hucMSCs-exosomes對正常細胞的生長及氧化應激導致的細胞損傷的作用。
　　 方法:采用臍帶組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)hucMSCs;利用超濾及密度梯度離心法

2、從hucMSCs的條件培養(yǎng)上清中分離并純化hucMSCs-exosomes,通過透射電鏡進行形態(tài)學觀察及Western blotting檢測exosomes表面相關標志蛋白CD9、CD81,通過蛋白質雙向電泳進一步分析其蛋白構成;將分離純化的hucMSCs-exosomes體外分別應用于正常/過氧化氫損傷的大鼠心肌細胞(H9C2(2-1))、人肝細胞(HL-7702)、大鼠腎上皮細胞(NRK-52E)這三種細胞株,觀察hucMSCs-e

3、xosomes在體外對正常細胞的生長及氧化應激導致的細胞損傷的干預作用;綜合運用MTT、免疫組織化學等技術檢測hucMSCs-exosomes對正常細胞的促增殖作用及對氧化應激導致的細胞損傷的預防效果;運用免疫熒光、Westem blotting、Luminex等技術尋找hucMSCs-exosomes影響細胞生長的可能機制。
　　 結果:采用超濾及密度梯度離心法成功分離純化得到hucMSCs分泌的exosomes。透射電鏡下觀

4、察,hucMSCs-exosomes呈橢圓或碟形的囊泡狀結構,直徑約為40nm～100nm。hucMSCs-exosomes含有多種蛋白,并在不同的保存條件下有一定的穩(wěn)定性:蛋白質雙向電泳的結果進一步顯示人臍帶來源的exosomcs和人肺成纖維細胞來源的exosomes具有大量差異性表達的蛋白;Western blotting顯示exosomes表達標記蛋白CD9、CD81。hucMSCs-exosomes對正常培養(yǎng)的H9C2(2-1)

5、、HL-7702、NRK-52E細胞株通過激活ERK1/2起到促增殖作用。對過氧化氫損傷的H9C2(2-1)、HL-7702、NRK-52E,則可在一定程度上逆轉細胞損傷,這可能通過活化MAPK通路中p38而起到抗凋亡作用。
　　 結論:采用超濾及密度梯度離心法可以成功從人臍帶間質干細胞的條件培養(yǎng)上清中分離純化得到exosomes。hucMSCs來源的exosomes在體外能夠通過活化ERK1/2促進細胞增殖,通過活化MAPK通