轉(zhuǎn)人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的臍帶間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腦出血后神經(jīng)功能改善的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的
　　 1.建立穩(wěn)定、可靠的腦出血模型,為進(jìn)一步研究腦出血的神經(jīng)功能恢復(fù)和治療效果奠定基礎(chǔ)；同時(shí)探討腦出血后脫髓鞘病變的病理變化。
　　 2.從人臍索中分離、培養(yǎng)、傳代并鑒定間質(zhì)干細(xì)胞,為將來(lái)開(kāi)展干細(xì)胞的治療創(chuàng)造條件。
　　 3.運(yùn)用慢病毒載體將HGF轉(zhuǎn)染間質(zhì)干細(xì)胞,建立高效、穩(wěn)定表達(dá)HGF基因的人臍帶來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞,為疾病的基因和細(xì)胞的聯(lián)合治療打下基礎(chǔ)。
　　 4.觀(guān)察HGF轉(zhuǎn)染的間質(zhì)干細(xì)胞和

2、單純間質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦出血的神經(jīng)功能改善情況,探討HGF和間質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制,為腦出血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的治療手段。
　　 研究方法
　　 1.健康SD雄性大鼠50只,鼠齡約12周,重220克。隨機(jī)分為腦出血模型組和假手術(shù)組(各20只)、正常大鼠組(10只)共三組。通過(guò)注射Ⅳ膠原酶至大鼠內(nèi)囊處誘導(dǎo)腦出血大鼠模型,假手術(shù)組注射等量的PBS。運(yùn)用rotarod test和mNSS功能評(píng)分分別于造模

3、型術(shù)前1天、術(shù)后1、7、14、21、28、35天進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)功能檢測(cè)大鼠的神經(jīng)功能損害情況。H&E、luxol fast blue染色、toluidine blue染色和MRI檢測(cè)腦組織的病理變化；分別用免疫組織化學(xué)染色和Western blot蛋白定量分析檢測(cè)髓鞘堿性蛋白(myelin basicprotein,MBP)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(growt

4、h-associated protein-43,GAP-43),評(píng)價(jià)腦出血后的病理改變和神經(jīng)纖維的脫髓鞘病變情況。
　　 2.在征得胎兒父母同意后,取產(chǎn)后臍帶用于間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的分離和培養(yǎng)。采用酶消化法分離、DMEM中培養(yǎng)間質(zhì)干細(xì)胞,并進(jìn)行傳代。觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)學(xué),通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型鑒定間質(zhì)干細(xì)胞。
　　 3.通過(guò)慢病毒載體系統(tǒng)(pWPI、pAX2和MD2G)將hHGF基因轉(zhuǎn)染人臍帶MSC。將hHGF基因克隆

5、至pWPI載體的PMEI酶切位點(diǎn),再將轉(zhuǎn)染基因的pWPI和pAX2、MD2G一起感染293T細(xì)胞獲得重組慢病毒,再轉(zhuǎn)染hUCMSC,獲得轉(zhuǎn)染HGF的間質(zhì)干細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀(guān)察GFP的表達(dá)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。Western blotting和ELISA檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清液的hHGF的含量。
　　 4.80只SD雄性大鼠(220g,鼠齡12周),隨機(jī)分為HGF.MSC、MSC、PBS和正常組,每組20只大鼠。腦出血模型后7天分別于

6、出血對(duì)側(cè)腦室在立體定位儀下緩慢注入等容量HGF-MSC、MSC、PBS,含細(xì)胞數(shù)為6×105。分別于造模型術(shù)前1天、術(shù)后1、7、14、21、28、35天進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)功能檢測(cè)神經(jīng)功能恢復(fù)情況。Luxol fast blue染色觀(guān)察腦組織的神經(jīng)纖維改善情況；分別用免疫組織化學(xué)染色和Western blot蛋白定量分析檢測(cè)MBP、MAG和GAP-43的變化,評(píng)價(jià)經(jīng)過(guò)細(xì)胞移植和基因治療后腦出血后的神經(jīng)纖維髓鞘再生情況,探討其對(duì)神經(jīng)再生的可能作

7、用機(jī)制。
　　 研究結(jié)果
　　 1.成功建立腦出血模型,膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型后大鼠表現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙。模型建立后,H&E、luxol fast blue染色、toluidine blue染色和MRI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦損傷區(qū)出現(xiàn)脫髓鞘病變等腦出血病理改變。免疫組織化學(xué)和Westernbloting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MBP和GAP-413的表達(dá)在腦出血后較對(duì)照組明顯減少,而MAG的表達(dá)在出血后升高。
　　 2.從人臍帶成功分離、

8、培養(yǎng)到間質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞呈長(zhǎng)的扁平的梭形,細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng),類(lèi)似成纖維細(xì)胞,具有干細(xì)胞的形態(tài)特征。流式細(xì)胞儀免疫表型:CD29、CD44、CD90、CD105、CD166陽(yáng)性表達(dá)達(dá)96.3％以上,而HLA—DR、CD3、CD16、CD19、CD33、CD34、CD38、CD45和CD133等呈陰性表達(dá),符合間質(zhì)干細(xì)胞的表型特征。
　　 3.慢病毒載體系統(tǒng)成功轉(zhuǎn)染HGF至MSC。熒光顯微鏡下觀(guān)察HGF的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)80％。Western

9、 blotting和ELASA檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后上清液的HGF含量顯著高于未轉(zhuǎn)染基因者,獲得HGF在間質(zhì)干細(xì)胞的高效表達(dá)和分泌。
　　 4.腦出血模型后hUCMSCs-HGF組的神經(jīng)功能恢復(fù)較hUCMSCs和PBS組明顯提高,hUCMSCs-HGF組的神經(jīng)纖維修復(fù)達(dá)較其它組明顯改善。免疫組織化學(xué)和Western bloting結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因組的MBP和GAP-43的表較其它組表達(dá)增強(qiáng),而MAG表達(dá)減弱。
　　 結(jié)論

10、　　 1.腦出血后神經(jīng)功能的缺失與腦損傷后脫髓鞘病變有關(guān),MBP、GAP-43和MAG是反映腦出血后神經(jīng)纖維退行性變的敏感標(biāo)志物,這可以為作為將來(lái)的治療觀(guān)測(cè)指標(biāo)和靶點(diǎn)。
　　 2.人臍索可成功分離、培養(yǎng)而獲得間質(zhì)干細(xì)胞。通過(guò)慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)HGF基因hUCMSC后可獲得HGF的高效表達(dá)和分泌,為神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的治療提供良好條件。
　　 3.本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明ICH神經(jīng)功能的改善與神經(jīng)纖維的修復(fù)相一致,提示神經(jīng)纖維是一種新的治療