一種用于A型鴨甲肝病毒檢測的類病毒顆粒制備.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是雛鴨的一種急性致死性疾病，以肝炎和高死亡率為主要特征，病原是鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus，DHV)。我國流行的鴨肝炎以A型鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis AVirus，DHAV-1)為主。DHAV-1由于個體很小，純化較為困難。通過桿狀病毒表達系統(tǒng)制備DHAV-1類病毒顆粒(virus-like particle，VLP)，可以更方便的獲

2、得病毒人工抗原，通過純化，可將其用于DHAV-1的檢測，以輔助該病的預防和控制工作，亦可作為潛在的候選疫苗或以此為抗原制備單克隆抗體建立免疫學診斷方法奠定基礎。
　　 小RNA病毒(Picomavirus)病毒衣殼具有相似的組裝模式，以3CD蛋白水解酶將P1結(jié)構蛋白前蛋白切割成單一的結(jié)構蛋白再組裝而成。本實驗根據(jù)DHV-1 JX株基因組序列，設計含有BamHⅠ和SalⅠ酶切位點的P1基因引物，含有XhoⅠ和KpnⅠ酶切位點的3C

3、D基因引物，以JX株RNA為模板，RT-PCR擴增P1和3CD基因。隨后運用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，將DHAV-1的3CD水解酶與P1多聚蛋白基因放入同一個重組桿狀病毒(vBac-P1-3CD)中，利用單一感染的方式同時表達兩種蛋白來產(chǎn)生類病毒顆粒。利用電鏡觀察感染細胞的超薄切片，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)有類病毒顆粒堆積，顆粒大小35-40nm，再結(jié)合蔗糖不連續(xù)密度梯度離心的超速離心后，獲得類病毒顆粒，負染后電鏡觀察，確認顆粒主要以兩種