1型鴨甲肝病毒VP3蛋白間接ELISA方法的建立及其B細(xì)胞表位鑒定.pdf

1、鴨甲型肝炎病毒(duck hepatitisA virus，DHAV)是一種無(wú)囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組RNA編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)病毒的組裝和致病性有重要作用。VP3蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，位于衣殼表面，相對(duì)保守，是病毒粒子抗原性的主要決定因子，存在著眾多抗原表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。1型鴨甲肝病毒(DHAV-1)是分布最廣、危害最大的DHAV，本研究對(duì)DHAV-1的VP3進(jìn)行原核表達(dá)和純化，并制備免抗VP

2、3多克隆抗體，通過雞胚中和試驗(yàn)探究VP3多抗血清的中和活性;通過間接ELISA對(duì)VP3上可能存在的B抗原表位進(jìn)行鑒定;建立基于VP3的檢測(cè)DHAV抗體的間接ELISA方法。
　　1.DHAV-1 VP3的原核表達(dá)、純化及鑒定
　　通過RT-PCR得到了預(yù)期大小的VP3片段，將目的片段先后T-A克隆至pMD19-T(simple)和亞克隆至pGEX-4T-1，分別構(gòu)建了重組T質(zhì)粒pMD19-VP3和重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-VP3

3、。pGEX-VP3轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后表達(dá)的重組蛋白約50kD。以0.2mmol/L IPTG、37℃誘導(dǎo)8h表達(dá)量最大，且始終以包涵體形式表達(dá)。采用切膠純化獲得的重組蛋白純度高。Westemblot表明重組蛋白可被兔抗DHAV-1抗體識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。
　　2.DHAV-1 VP3的抗血清中和活性分析及B細(xì)胞表位鑒定
　　利用純化的VP3重組蛋白乳劑免疫雄兔，經(jīng)五免后瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的效價(jià)均達(dá)到1∶16。Weste

4、m blot證明兔抗血清可與VP3蛋白特異性結(jié)合。雞胚中和試驗(yàn)表明VP3抗血清的中和效價(jià)為2-5.29。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件綜合分析VP3序列的柔韌性、表面可及性、親水性和抗原性，預(yù)測(cè)出四條B細(xì)胞表位多肽送公司合成。以制備的VP3多克隆抗體作一抗，VP3蛋白作抗原進(jìn)行間接ELISA，確定了表位肽的最佳稀釋度為1∶1280，然后以該濃度稀釋的表位肽作抗原進(jìn)行間接ELISA鑒定B細(xì)胞表位，結(jié)果證明1GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP0、

5、131FNTGRYQMSWYPIA DGEQSL150和200VNSSAPSNID209能與VP3多克隆抗體特異性結(jié)合，為VP3的B細(xì)胞表位。進(jìn)一步用DHAV-1臨床鴨血清樣品對(duì)B表位的抗體檢測(cè)能力進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明表位肽可用于檢測(cè)DHAV-1抗體。
　　3.基于DHAV-1 VP3蛋白的間接ELISA方法的建立
　　通過條件的摸索，得到以VP3作為包被抗原的間接ELISA方法的最佳檢測(cè)條件為:以9.375 ng/μL蛋白濃