豬戊型肝炎DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效果的初步研究.pdf

1、目的：構(gòu)建豬戊型肝炎病毒ORF3基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/ORF3,并在COS-7細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)肌肉注射與IL-2聯(lián)合免疫Balb/C小鼠，檢測(cè)其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平，以期望通過(guò)基因疫苗作用使小鼠對(duì)戊肝病毒產(chǎn)生免疫防御能力。 方法：用PRIMER5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增ORF3全基因，將PCR產(chǎn)物純化后插入pcDNA3.1(+)載體，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/ORF3轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α進(jìn)行

2、大量復(fù)制。轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)和Westenrn-Blot驗(yàn)證其在真核細(xì)胞得到表達(dá)后，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/ORF3、對(duì)照空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)及生理鹽水分組通過(guò)肌肉注射免疫6周齡Balb/C雌鼠，隔兩周免疫一次，共免疫3次，第二周加白介素2輔佐免疫。初免后每隔2周采用ELISA間接法測(cè)定小鼠血清中抗ORF3 IgM抗體水平。通過(guò)PCR法檢測(cè)小鼠肌細(xì)胞中ORF3基因的存在。 結(jié)果：成功克隆了ORF

3、3基因，構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/ORF3重組真核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒能在COS-7細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)目的蛋白。小鼠接種pcDNA3.1(+)/ORP3 核酸疫苗后能產(chǎn)生特異性IgM抗體。PCR檢測(cè)ORF3基因可在小鼠肌細(xì)胞中存在。 結(jié)論： （1）成功克隆了豬戊型肝炎病毒ORF3基因。 （2）成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/ORF3真核表達(dá)載體且其能在真核細(xì)胞中表達(dá)。 （3）pcDNA3.1(+)/ORF