表達(dá)載體的構(gòu)建方法及步驟

1、表達(dá)載體的構(gòu)建方法及步驟一、載體的選擇及如何閱讀質(zhì)粒圖譜目前，載體主要有病毒和非病毒兩大類其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素：（1）復(fù)制起始位點(diǎn)i即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。（2）抗生素抗性基因可以便于加以檢測，如AmpKan（3）多克隆位點(diǎn)MCS克隆攜帶外源基因片段（4）PE啟動(dòng)子增強(qiáng)子（5）Terms終止信號(hào)（6）加poly（A）

2、信號(hào)可以起到穩(wěn)定mRNA作用選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：【1】構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增基因表達(dá)，選擇合適的克隆載體表達(dá)載體。【2】.載體的類型：（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大?。ù筮x大，小選小）。如10kb第一步：首先看i的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核真核穿梭質(zhì)粒）第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決

3、定使用什么篩選標(biāo)記。（1）Ampr水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。（2）tetr可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。（3）camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。（4）ne（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418（長那霉素衍生物）失活（5）hygr使潮霉素β失活。第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些酶切位點(diǎn)以外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因

4、以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。第六步：啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)（1）啟動(dòng)子－