載體構(gòu)建步驟

1、一載體酶切線性化（TOYOBOEcI）1.載體pCDNA濃度0.8ugul2.酶切體系（總50ul體系）pCDNA3ul10HBuffer5ulddH2O41ulEcI1ul（8Uul）3.反應(yīng)條件37C1h至多2h已經(jīng)試過37C過夜，本以為會(huì)酶切充分，但是不想把條帶全切成小片段了，而且電泳后是一條寬寬的泳譜另外，多次酶切證實(shí)，所加的酶量過多在酶切一小時(shí)的情況下仍然會(huì)出現(xiàn)酶切過度的情況，盡可能按照說明書上的量和時(shí)間做二取2ul稀釋成5u

2、l于1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定有無條帶及大小用大凝膠回收pcDNA（按2.5：1加入SYBRGreen）電泳30min準(zhǔn)備兩支準(zhǔn)備兩支EPPendf管，調(diào)管，調(diào)60C水浴鍋水浴鍋切膠稱重（1.5mlEPPendf管重約0.82g）三OMEGAgelpurificationkit回收pcDNA1.平衡柱子加200ulBufferGPS到DNA收集柱中，靜置4min，12000xg2min，加700ulDEPC處理H2O，12000xg2m

3、in2.溶膠按1mlkg的比例加BindingBuffer到凝膠中3.60C水浴7mins，迅速轉(zhuǎn)移至DNA收集柱中（至多700ul，超過的再轉(zhuǎn)移一次），10000xg1min，棄收集管中的液體4.加300ulBindingBuffer，10000xg1min，棄收集管中的液體5.加700ulwashBuffer，10000xg1min，棄收集管中的液體6.加350ulwashBuffer，10000xg1min，棄收集管中的液體7.最

4、大轉(zhuǎn)速（13000rpm）空轉(zhuǎn)2min，棄收集管8.轉(zhuǎn)移收集柱至1.5mlEPPendf管，打開蓋子靜置2min9.加30ulElutionBuffer靜置2min，最大轉(zhuǎn)速1.5min，棄收集柱10.取2ul稀釋成5ul點(diǎn)膠所加ElutionBuffer的量是根據(jù)所純化的產(chǎn)物的量來判斷的，如果回收產(chǎn)物較多可以增加其量至50ul純化的理論效率為70%，如果先加一次ElutionBuffer20ul，靜置2min，1000xg1min然后

5、再加一次ElutionBuffer20ul，靜置離心。這樣回收效率可以達(dá)到90%，不過終濃度會(huì)變稀四去磷酸化處理（TOYOBOBAP）1.反應(yīng)體系（總200ul）DNA520pmoles10Buffer20ulBAP2U（0.5Uul）ddH2OUpto200ul做去p之前，必須得將之前的純化物點(diǎn)膠以確信是否有完整的DNA，我已經(jīng)在這個(gè)問題上吃過三次虧了，謹(jǐn)記！??！2.反應(yīng)條件：37C60min（5’黏末端）60C60min（3’黏末端

6、，平末端）1ml吸樣槍，大Tip頭，新近滅菌的小Tip頭，記號(hào)筆，橡皮筋1.取滅菌的搖菌管于泡沫底座上，編號(hào)2.每管加入5ml含AmpLB培養(yǎng)基3.挑取散在的獨(dú)立的直徑在12mm間的菌斑至對(duì)應(yīng)編號(hào)的搖菌管中4.37C200轉(zhuǎn)min搖菌過夜蓋蓋子并保持蓋子不蓋死以防細(xì)菌缺氧死掉Tip頭需要無菌，操作過程中盡量做到不污染，尤其不能污染培養(yǎng)基童教授建議在挑菌的時(shí)候可以挑取不同大小的菌落做載體構(gòu)建的師兄提供信息說，一般可能6個(gè)菌落可以出來一個(gè)陽

7、性的菌落，所以如果平板上的菌落在10個(gè)以內(nèi)，那就全挑了吧有人提出，考慮到陽性菌落少，為避免之后大量提取質(zhì)粒酶切鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)money，而提出了菌落PCR，即將長出的菌落挑取到1.5mlEP管中200rpm1h，之后去2ul菌落在100C沸水浴15min，用基因的上下游引物做PCR，但此只能做為初篩，引物P出來的東西并不能判斷是來自重組的載體還是來自連接體系本身過剩的插入片段。但不排除將此方法作為初篩在減少成本方面功效明顯不過我也在想另

8、一個(gè)方法就是，我們的pcDNA多克隆位點(diǎn)兩端是有T7和SP6的，我們可以T7和SP6做PCR，這樣可以把來自原本過剩的插入片段完全排除在外，不過僅限于想法，尚未來得及驗(yàn)證！九提質(zhì)粒（TIANprepMini質(zhì)粒小提試劑盒）1.柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過的柱子）2.取15ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心

9、管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12000rpm離心1分鐘，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）3.向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液P1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低4.向離心管中加入250ul溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6－8次使菌體充分裂解溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗?，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片斷此時(shí)菌液應(yīng)變

10、得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量5.向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6–8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10分鐘，此時(shí)在離心管底部形成沉淀P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清6.將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，注意盡量不要吸出沉淀。12000r