載體構(gòu)建_第1頁
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1、載體構(gòu)建分為以下步驟：1.載體的選擇和引物設(shè)計以擴增目標基因2.目標片段的PCR擴增3.載體和目標片段的限制性酶切4.連接轉(zhuǎn)化5.挑取克隆提質(zhì)粒6.單克隆的驗證及送樣測序。載體的選擇載體的選擇實驗室常用的載體有pUC19（擴繁目標片段），pet28a（原核表達載體Kna），pGEX4T1(原核表達載體Amp)，pCINEO(真核表達載體Amp)，pCDNA3.1(真核表達載體Amp)，pLKO.1(shRNA構(gòu)建Amp)。根據(jù)所要構(gòu)建的

2、質(zhì)粒目的的差異以及載體和目標片段的酶切位點分析結(jié)果來選擇載體。舉例如下：實驗?zāi)康氖菍YC基因插入到載體中，轉(zhuǎn)染進細胞中表達。應(yīng)選用真核表達載體pCINEO或pCDNA3.1。引物設(shè)計引物設(shè)計引物設(shè)計的目的是將目標片段擴增出來以便與載體連接，所以在引物的兩端應(yīng)人為加上酶切位點，酶切位點前加上保護堿基。在選擇酶切位點是應(yīng)注意，選擇的應(yīng)該是目的基因片段中沒有而載體上有的限制性內(nèi)切酶，防止目標片段被切不完整，也便于和載體連接。載體構(gòu)建之后我們

3、的目的是要表達，所以應(yīng)該加入標簽以便westernblot檢測蛋白是否表達。常用的標簽有Flag標簽、6XHis標簽、HA標簽和Myc標簽。Flag標簽：DYKDDDDKGATTACAAGGATGACGACGATAAG6XHis標簽：HHHHHHCACCACCACCACCACCACHA標簽：YPYDVPDYATACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTMyc標簽：EQKLISEEDL這些標簽被表達成氨基酸后，特定的氨基酸序列會

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