鏈霉菌高表達(dá)載體與標(biāo)簽載體的構(gòu)建及其應(yīng)用.pdf

1、鏈霉菌是一類(lèi)生活在土壤中的革蘭氏陽(yáng)性菌，其能產(chǎn)生多種具有商業(yè)和科研價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物、酶和免疫抑制劑等。近年來(lái)鏈霉菌已經(jīng)逐漸發(fā)展為外源基因表達(dá)的宿主。本課題在pIJ8668載體和pIJ101復(fù)制子的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一組高表達(dá)載體pL97，pL98和pL99。pL97和pL98分別具有組成型啟動(dòng)子ermEp*和ssrAp，而pL99具有誘導(dǎo)性啟動(dòng)子PnitA-NitR系統(tǒng)。三個(gè)載體都具有pUC18和pIJ101的復(fù)制子，分別用于在大腸桿菌和

2、鏈霉菌體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，同時(shí)oriT(RK2)原件使大腸桿菌到鏈霉菌的結(jié)合轉(zhuǎn)移更加高效簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化子的篩選可以通過(guò)阿布拉霉素進(jìn)行。在啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)用于外源基因的表達(dá)。前期實(shí)驗(yàn)我們將綠色熒光蛋白基因egfp和天藍(lán)色鏈霉菌十二烷基靈菌紅素(Red)的途徑特異性調(diào)控基因redD克隆至上述三個(gè)載體中，Westernblot結(jié)果顯示EGFP蛋白的表達(dá)與單拷貝的相比有了明顯的提高，同時(shí)Red的產(chǎn)量通過(guò)組成型過(guò)表達(dá)redD也有

3、了顯著變化。因此上述三種載體可以用于外源蛋白的表達(dá)和次級(jí)代謝產(chǎn)物尤其是一些具有潛在應(yīng)用價(jià)值的抗生素產(chǎn)量的提高。
　　 經(jīng)過(guò)多年的研究，鏈霉菌遺傳學(xué)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，解析了大量基因的功能，但是在以研究蛋白質(zhì)相互作用及蛋白質(zhì)-DNA相互作用為基礎(chǔ)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面報(bào)道不多。本課題以整合性啟動(dòng)子探針質(zhì)粒pIJ8660為骨架，將EGFP編碼序列改為多克隆位點(diǎn)，并在其前端插入了組成型強(qiáng)啟動(dòng)子ermEp*，以此為基礎(chǔ)，通過(guò)密碼子優(yōu)化，

4、將3FLAG，3HA，13Myc，3Strep-tagⅡ，18His標(biāo)簽蛋白編碼序列分別插入到啟動(dòng)子下游，構(gòu)建了一系列含單個(gè)標(biāo)簽或者兩個(gè)標(biāo)簽的載體，并以天藍(lán)色鏈霉菌ECFsigma因子SigT為模型，成功實(shí)現(xiàn)了標(biāo)簽與蛋白的融合表達(dá)。在此基礎(chǔ)上我們利用FLAG-His串聯(lián)親和純化技術(shù)(TAP)結(jié)合LC-MS的方法鑒定出了與SigT相互作用的蛋白，其中包括SigT蛋白的抗sigma因子RstA。該系列標(biāo)簽載體的構(gòu)建，為蛋白在鏈霉菌內(nèi)的表達(dá)、