植物激活標(biāo)簽載體的構(gòu)建及其對擬南芥和油菜的轉(zhuǎn)化.pdf

1、油菜是一種異源二倍體植物,分為不同的品種。實驗中選用的中雙11號油菜屬于半冬性甘藍(lán)型常規(guī)油菜品種,是正在大面積推廣的雙低油菜新品種,也是目前通過傳統(tǒng)育種方法選育的最適合機(jī)械收獲的油菜品種,是轉(zhuǎn)基因改良的重要候選品種之一。油菜的遺傳轉(zhuǎn)化受品種和基因型的影響很顯著,目前還沒有針對中雙11號油菜的遺傳轉(zhuǎn)化方法,本研究探討了中雙11號油菜的遺傳轉(zhuǎn)化方法,研究結(jié)果如下:
　　 一、以質(zhì)粒pZP212為模版擴(kuò)增出2x35s Enhancer

2、片段,將該片段連接到載體pBluescriptⅡ SK(+)中,得到載體pWBH003,之后在又將2xEnhancer片段連接到載體pWBH003中,得到含有四個正向串聯(lián)重復(fù)的35sEnhancer的載體pWBH004,最后將載體pWBH004亞克隆到載體pSB2GW7,得到用于遺傳轉(zhuǎn)化的載體pWBH005。所有的中間載體及終載體經(jīng)測序均為正確的。
　　 二、將構(gòu)建好的載體pWBH005轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,用于侵染哥倫比亞野

3、生型擬南芥,篩選得到具有Basta抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥,證明實驗中構(gòu)建的雙元載體pWBH005是可以用于轉(zhuǎn)化植物的,為做中雙11號油菜的遺傳轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ),并且篩選出了長勢較野生型弱,提早開花的突變體。
　　 三、將構(gòu)建好的載體pWBH005轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,用于中雙11的遺傳轉(zhuǎn)化。首先測試了抗性篩選基因(抗barsta)對中雙11最佳篩選濃度,接著研究了獲得轉(zhuǎn)基因再生植株的過程,實驗步驟是:
　　 (1)在1/2MS

4、培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌苗;
　　 (2)取5d苗齡的無菌苗下胚軸,將它們切成5-8mm的小段,于預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天;
　　 (3)農(nóng)桿菌侵染外植體與共培養(yǎng):農(nóng)桿菌侵染30min,在黑暗條件下,共培養(yǎng)2d:
　　 (4)篩選分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生芽一個月;
　　 (5)生根培養(yǎng)基上進(jìn)行一個月的生根培養(yǎng):
　　 (6)煉苗一周后移栽到土壤中。所有的培養(yǎng)基均以1/2MS為基本培養(yǎng)基,添加相應(yīng)濃度的植物激素、篩選劑

5、、抗生素等。培養(yǎng)基中蔗糖含量為15g/L或30g/L。PCR鑒定顯示,我們獲得了T0代的轉(zhuǎn)基因植株,之后將T0代轉(zhuǎn)基因植株結(jié)的種子播種下去獲得T1代植株,我們在T1代植株中通過PCR擴(kuò)增特異性條帶的方法檢測到陽性植株。
　　 在實驗過程中,由于中雙11油菜為冬油菜,開花需要春化誘導(dǎo),而多數(shù)轉(zhuǎn)基因油菜再生植株是在油菜非自然生長季節(jié)獲得的,無法正常開花結(jié)實,嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥暮罄m(xù)工作。我們探討了反季節(jié)誘導(dǎo)中雙11油菜開花的方法,成