hADRB1表達載體的構建及應用.pdf

1、華東師范大學碩士學位論文hADRB1表達載體的構建及應用姓名：杜林申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：賴立輝20070501華東師范丈學碩士論文分子與化學生物學研究所hADRBl表達載體的構建及應用專業(yè)：生物化學與分子生物學研究生：杜林指導老師：賴立輝中文摘要：【目的】腎上腺素能受體(AdrenergicreceptorAR)是典型的G蛋白偶聯(lián)受體家族(OPCR)成員。介導交感神經遞質去甲腎上腺素(NE)和腎上腺素的中

2、樞和外周作用，它在心血管系統(tǒng)的調節(jié)如血壓、心率、心肌收縮、物質代謝等方面具有十分重要的地位。B受體和G蛋白偶聯(lián)調節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性。刺激B受體增加胞內cAMP的水平，而阻斷B受體則降低胞內cAMP的水平。因此，刺激或阻斷B受體可調節(jié)PKA和／或MAP激酶(MAPK)的活性，從而調節(jié)核內特異cAMP反應因子結合蛋白(cREB)的活性，引起特異的生物學效應。既往實驗證明，杏仁復合體B受體參與調控LTP和條件性恐懼記憶，大鼠海馬CAl區(qū)13

3、受體參與長時程增強和空間學習。目前對B腎上腺素受體功能及機制的研究主要是通過生理學的研究方法，注射藥物——觀察整體——推測功能。而我們則從基因功能研究角度出發(fā)，構建ADRBl上調、下調載體，包裝成重組腺相關病毒載體，并最終制備轉基因動物，以觀察由于Bl腎上腺素受體表達量的改變所引起的生物學、行為學效應，以此研究BI腎上腺素受體在學習和記憶中的作用?！痉椒ā?采用基因過表達方式，構建ADRBI上調載體。2采用RNA干擾技術，構建ADRBl

4、下調載體。3根據(jù)細胞轉染、流式細胞術及實時熒光定量PCR結果篩選出包裝病毒的候選載體。4利用AAVHelperfreesystem生產重組腺相關病毒。5采用一步柱純化法和“氯仿處理PEG／NaCI沉淀氯仿抽提”法，對病毒的初級產物進行濃縮和純化。6通過表達載體所攜帶的綠色熒光測定重組腺相關病毒的滴度。【結果】1構建了hADRBl上調、下調表達載體，并通過了酶切鑒定，細胞轉染、流式細胞術及實時熒光定量PCR的驗證。2包裝并純化了含hADR