溶藻弧菌毒力相關(guān)基因的檢測與保藏方法的研究.pdf

1、溶藻弧菌對宿主的致病性與溶藻弧菌產(chǎn)生的各種毒力因子息息相關(guān)。本研究以溶藻弧菌的膠原蛋白酶基因(Collagenase)、堿性絲氨酸蛋白酶基因(Alkaline serine exoprotease,AspA)、鞭毛絲蛋白基因(FlaA)、鐵攝取調(diào)節(jié)基因(fur)、毒力調(diào)控基因toxR以及toxS作為目的基因,采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)對不同保藏方法其表達(dá)量進(jìn)行檢測。
　　 選取實驗室保存的8株溶藻弧

2、菌為對象,提取其總RNA為模板,根據(jù)GenBank上的全序列設(shè)計特異性引物,以16s基因為內(nèi)參照,研究了collagenase、AspA、FlaA、fur、toxR以及toxS基因的表達(dá)量。再分別用這8株菌對羅非魚進(jìn)行傳統(tǒng)攻毒實驗,觀測其致死率,分析其毒性強(qiáng)弱。結(jié)合兩部分研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),溶藻弧菌的collagenase、AspA、FlaA、toxR以及toxS基因的表達(dá)量與溶藻弧菌的毒力具有相關(guān)性；而fur基因則與溶藻弧菌的毒力不具有相關(guān)

3、性。
　　 采用斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、生理鹽水保藏法以及甘油液保藏法對實驗室同一株溶藻弧菌強(qiáng)毒株進(jìn)行為期一年的保藏,再用實時熒光定量PCR對其各毒力相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測。分析發(fā)現(xiàn),本研究所采取的四種保藏手法都能較好的保持菌種的存活率以及遺傳穩(wěn)定性,其中斜面低溫保藏法效果尤為明顯。另外,研究還發(fā)現(xiàn)鐵攝取調(diào)節(jié)基因(fur)和毒力調(diào)控基因toxS在不同的保藏手法下表達(dá)量始終保持相對穩(wěn)定。
　　 本論文的研究成果為