環(huán)境溶藻細(xì)菌的檢測(cè)與評(píng)價(jià).pdf

1、我國(guó)富營(yíng)養(yǎng)化湖泊的比例達(dá)到60％，太湖、滇池等重要水源水體在夏秋季節(jié)頻繁爆發(fā)藍(lán)藻水華，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)厝嗣裆詈凸まr(nóng)業(yè)發(fā)展。在各種理化手段治理效果不甚理想的情況下，微生物除藻技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。溶藻細(xì)菌在此技術(shù)中起著重要的作用。本課題旨在建立分子生物學(xué)方法分析、檢測(cè)環(huán)境溶藻細(xì)菌，并對(duì)太湖土著溶藻細(xì)菌進(jìn)行分離與除藻效果的初步評(píng)價(jià)，為微生物除藻技術(shù)的構(gòu)建和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 本文分四個(gè)部分進(jìn)行闡述： 1.環(huán)境溶

2、藻細(xì)菌PCR定性檢測(cè)法的建立 假單胞菌屬是較為常見(jiàn)的環(huán)境溶藻細(xì)菌。本研究根據(jù)假單胞菌屬16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)細(xì)菌。針對(duì)PCR反應(yīng)條件中的Mg2+、dNTP、引物、Taq酶，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了假單胞菌屬特異性引物PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為20μL，含DNA70～100ng、dNTP300μM、上下游引物各10pm、Mgcl21.0mM、Taq酶1.5個(gè)單位、10×Reacti

3、onBuffer2.5μL。熱循環(huán)條件為：95℃，5min；30個(gè)循環(huán)，92℃，1min；64.1℃，1min；72℃，1min；72℃，延伸10min。得到990bp的特異性條帶，此方法能夠快速檢測(cè)出環(huán)境樣本中的目標(biāo)菌屬，最低檢測(cè)限為3.0ngDNA。 2.環(huán)境溶藻細(xì)菌RTQ-PCR定量檢測(cè)法的建立 本研究應(yīng)用SYBRGreenⅠ標(biāo)記技術(shù)，與上章的最佳PCR條件相結(jié)合，建立了實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)假單胞菌屬在環(huán)境中的相對(duì)

4、豐度的RTQ-PCR方法。該方法對(duì)總細(xì)菌的檢測(cè)范圍為103～108個(gè)基因拷貝/μL(R2=0.997)，假單胞菌屬的檢測(cè)范圍為1～105個(gè)基因拷貝/μL(R2=0.994)。總細(xì)菌與假單胞菌屬初始拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式分別為：Ct(USU)=-3.9081LgCopynumber+46.0741，Ct(PSE)=-3.265LgCopynumber+22.6789。應(yīng)用該方法定量檢測(cè)太湖水樣及南京市污水處理廠活性污泥等環(huán)

5、境樣本中假單胞菌屬的豐度，證明此方法在檢測(cè)環(huán)境樣本中假單胞菌屬豐度的可行性。 3.溶藻細(xì)菌PCR檢測(cè)法在太湖水除藻研究中的應(yīng)用 應(yīng)用以上建立的常規(guī)PCR技術(shù)以及RTQ-PCR技術(shù)，分別對(duì)懸掛于太湖梅梁灣水域的除藻中試裝置中三種人工介質(zhì)富集的總細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行定性、定量分析。常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)8月份三種介質(zhì)定性分析發(fā)現(xiàn)，材料上富集大量的假單胞菌屬；實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)5-10月間三種介質(zhì)定量分析發(fā)現(xiàn)，三種介質(zhì)上目標(biāo)細(xì)

6、菌豐度分別為組合填料：0.84％、無(wú)紡布填料：0.58％、彈性填料：0.35％，其對(duì)假單胞菌的富集能力由強(qiáng)至弱為組合填料＞無(wú)紡布填料＞彈性填料。在α=0.05的水平上各個(gè)裝置中間縱面的細(xì)菌豐度高于進(jìn)水及出水縱面，后兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯的差異。每個(gè)縱面上，表面采樣點(diǎn)及底部采樣點(diǎn)上細(xì)菌的豐度低于中部采樣點(diǎn)。 4.溶藻細(xì)菌的分離及其評(píng)價(jià) 從太湖監(jiān)藻水華爆發(fā)時(shí)分離獲得了銅綠微囊藻，并經(jīng)高效液相色譜對(duì)其產(chǎn)毒量進(jìn)行分析。結(jié)果表明

7、，當(dāng)藻細(xì)胞起始濃度為7.8×106個(gè)/mL，采樣間隔為8小時(shí)，四個(gè)時(shí)間點(diǎn)每106個(gè)藻細(xì)胞的MC-LR產(chǎn)毒素量分別為0.3523μg、0.3047μg、0.2815μg、0.2271μg。于梅梁灣水域放置的除藻中試裝置的人工介質(zhì)上分離出一株溶藻細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理與生化特性、以及16SrRNA特異性引物擴(kuò)增綜合分析，初步鑒定該株菌屬于假單胞菌屬；該菌對(duì)源自太湖的銅綠微囊藻具有較強(qiáng)的溶藻作用。其最低溶藻濃度為105個(gè)/mL。在太湖水、PBS

8、以及BG11培養(yǎng)基等不同反應(yīng)體系內(nèi)，當(dāng)藻細(xì)胞初始濃度為7.8×106個(gè)/mL，投加菌液濃度為106個(gè)/mL時(shí)，該菌24小時(shí)藻細(xì)胞溶解率分別為85.9％，67.9％和91.0％，完全溶藻時(shí)間為48小時(shí)；該株細(xì)菌在去除微囊藻細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)MC-LR具有較強(qiáng)的降解作用。在微囊藻毒素LR起始濃度為2.6423μg/L的條件下，該細(xì)菌對(duì)MC-LR在作用18、36和72小時(shí)后的降解率分別為14.2％，51.3％和100.0％。由此為今后將該菌應(yīng)用于