溶藻弧菌攝鐵系統(tǒng)相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、鐵在溶藻弧菌致病過程中扮演著重要的角色,從宿主體內(nèi)獲得鐵的能力是弧菌定值、感染并導(dǎo)致疾病發(fā)生所必須,攝鐵系統(tǒng)的由此變得必不可少。然而宿主由于受機(jī)體的嚴(yán)密監(jiān)控而使得鐵維持在很低的水平,且主要以血紅素的形式存在,因此許多病原菌優(yōu)先利用血紅素作為鐵源。血紅素攝取系統(tǒng)的作用就是特異性捕獲宿主血紅素,解離出鐵離子,以便弧菌能夠在宿主魚體內(nèi)不因缺鐵而能正常生長和繁衍下去,這一過程促進(jìn)了溶藻弧菌攻擊宿主機(jī)體的非特異性免疫預(yù)防,進(jìn)一步引發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類弧

2、菌病。然而,溶藻弧菌如何利用血紅素鐵的機(jī)制尚沒有闡明。
　　本研究從溶藻弧菌攝鐵系統(tǒng)相關(guān)基因的基因克隆開始,通過熱啟動法 PCR擴(kuò)增了溶藻弧菌HY9901菌株血紅素攝取系統(tǒng)的6個相關(guān)基因(hutB、hutC、hutD、hutW、hutX和hutZ),并對該6個基因及相應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:hutB的ORF為870 bp,編碼289個氨基酸,含有1個長度為23 aa的信號肽序列,無跨膜結(jié)構(gòu)域,PI為6.45,蛋白相對分

3、子量為30.69 kDa。hutC的ORF為1038 bp,編碼345個氨基酸,無信號肽序列,有9個跨膜結(jié)構(gòu)域,PI為9.74,蛋白相對分子量為36.15 kDa。 hutD的ORF為780 bp,編碼259個氨基酸,無信號肽無跨膜區(qū),PI為6.73,蛋白相對分子量為28.83 kDa。hutW的ORF為1437 bp,編碼478個氨基酸,無信號肽無跨膜區(qū),PI為7.16,蛋白相對分子量為52.94 kDa。hutX的ORF為504 b

4、p,編碼167個氨基酸,無信號肽無跨膜區(qū),PI為5.85,蛋白相對分子量為18.59 kDa。hutZ的ORF為531 bp,編碼176個氨基酸,無信號肽無跨膜區(qū),PI為5.19,蛋白相對分子量為20.24 kDa。
　　通過模擬不同的鐵環(huán)境條件,利用qRT-PCR技術(shù)初步探究了9個血紅素攝取相關(guān)基因(hutBCD、exbBD、tonB和hutWXZ)在富鐵、缺鐵、正常和混合鐵培養(yǎng)基等不同鐵環(huán)境條件下表達(dá)量的變化差異。結(jié)果表明:溶

5、藻弧菌hutBCD、exbBD、tonB和hutWXZ在含有Fecl3的富鐵培養(yǎng)基中,表達(dá)量與對照組變化不大;在含有血紅素的環(huán)境下表達(dá)量皆顯著增長,尤其在鐵限制的環(huán)境下有血紅素存在時各基因的表達(dá)上調(diào)極顯著,且皆以倍比量增加;在含2-2'二聯(lián)吡啶的鐵限制環(huán)境下,hutBCD和hutWXZ基因的表達(dá)量都會出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象,而exbBD和tonB基因的表達(dá)量會出現(xiàn)相反的顯著上調(diào)現(xiàn)象,且exbBD和tonB在鐵限制的環(huán)境下有FeCl3時,表達(dá)量上調(diào)

6、顯著,且比添加2-2'二聯(lián)吡啶的缺鐵實(shí)驗組的表達(dá)量高。
　　利用pET-28a(+)順利構(gòu)建了血紅素攝取系統(tǒng)5個基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-hutB、pET-hutD、pET-hutW、pET-hutX和pET-hutZ,將其在BL21表達(dá)菌株中誘導(dǎo)表達(dá),之后對誘導(dǎo)表達(dá)條件和蛋白純化條件進(jìn)行優(yōu)化,并獲得大量重組表達(dá)蛋白。SDS-PAGE和蛋白印跡檢測分析表明5個重組蛋白表達(dá)成功且都有免疫反應(yīng)性,且條帶大小與預(yù)期一致。
　　用純

7、化的HutB、HutW和HutZ重組蛋白對青石斑魚進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗,ELISA實(shí)驗結(jié)果顯示:抗體在3個免疫實(shí)驗組魚體中都能檢測到,且與對照實(shí)驗組的抗體效價差異顯著,各免疫試驗組的抗體水平在第四周的時候達(dá)到高峰,3個重組蛋白對青石斑免疫保護(hù)率分別為:82.61％,73.91%和78.26%?？梢?溶藻弧菌血紅素攝取系統(tǒng)相關(guān)蛋白HutB、HutW和HutZ都具有免疫原性,可作為疫苗候選抗原蛋白,為相關(guān)高效亞單位疫苗的開發(fā),進(jìn)行免疫和生態(tài)防治