養(yǎng)殖文蛤溶藻弧菌、頡頏菌的篩選與鑒定及其頡頏物質(zhì)的研究.pdf

1、文蛤的弧菌病害，是文蛤大量致死最主要的病害之一，其具有高傳染性，迅速性，難控性等特點(diǎn)。使用抗生素將造成文蛤養(yǎng)殖場(chǎng)及其周邊環(huán)境嚴(yán)重污染，同時(shí)可致使文蛤體內(nèi)病原菌的耐藥性增加，從而不利于文蛤的健康養(yǎng)殖。根據(jù)文蛤健康養(yǎng)殖及環(huán)境友好的原則，利用生物防治方法，即從養(yǎng)殖生境中獲取具有抑菌活性的土著微生物菌株用于防控文蛤病原菌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，可取得良好的文蛤病害防治效果。本文從文蛤養(yǎng)殖水體中篩選到一株假交替單胞菌（暫命名為SW-1），并對(duì)該菌進(jìn)行了

2、生理生化及分子生物學(xué)鑒定、生長(zhǎng)特征研究、抑菌效果研究，以及抑菌活性物質(zhì)研究，旨在為文蛤弧菌病害的生物防治提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　 從發(fā)病的文蛤中篩選到的菌株MP-1，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)和生理生化特征和16S rDNA序列分析，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的特征，鑒定為弧菌屬的溶藻弧菌，人工感染試驗(yàn)表明，菌株MP-1在107到109 cfu/ml濃度下，在15天內(nèi)文蛤的存活個(gè)數(shù)為0，死亡率為100％，其發(fā)病癥狀與溶藻弧菌在文蛤上的

3、典型癥狀相似，即可確定菌株MP-1為文蛤的致病菌之一。菌株MP-1的最佳生長(zhǎng)條件為:100 ml/250 ml的裝液量，30℃的溫度，pH8.0和0.5 mol/L的鹽度;生長(zhǎng)曲線顯示此菌滯后期較短，而且對(duì)文中所選多數(shù)抗生素表現(xiàn)出耐藥性。
　　 從文蛤養(yǎng)殖場(chǎng)的水體中篩選到一株對(duì)病原溶藻弧菌MP-1有抑菌作用、且對(duì)文蛤正常生長(zhǎng)無(wú)顯著影響的菌株SW-1。采用紙片擴(kuò)散法對(duì)菌株SW-1進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)，人工感染文蛤試驗(yàn)進(jìn)一步證明該菌株

4、SW-1的頡頏作用，菌株SW-1在109 cfu/ml濃度的情況下，15天后，文蛤的存活率為100％;與致病溶藻弧菌同時(shí)感染文蛤時(shí)，文蛤的致死率僅為11％，較單獨(dú)感染菌株MP-1的100％的致死率相比，文蛤成活率有顯著提高，可以作為一種潛在的生物防治文蛤致病菌行之有效的方法。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)和生理生化特征和16S rDNA序列分析，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的特征，鑒定菌株SW-1為假交替單胞菌屬的殺魚(yú)假交替單胞菌。菌株SW-1的最佳生長(zhǎng)條件為:30

5、ml/250 ml的裝液量，溫度30℃，pH8.0和鹽度0.5 mol/L。菌株SW-1生長(zhǎng)曲線與弧菌MP-1相比，具有滯后性，并且對(duì)試驗(yàn)中所選半數(shù)抗生素敏感。
　　 假交替單胞菌SW-1對(duì)試驗(yàn)中所選七種菌株均可以產(chǎn)生抑菌活性，抑菌圈大小范圍在16-25mm之間;菌株SW-1在生物量最高時(shí)，其抑菌效果最強(qiáng)。誘導(dǎo)試驗(yàn)證明，菌株SW-1可以產(chǎn)生非誘導(dǎo)性抑菌物質(zhì)對(duì)文蛤的致病弧菌MP-1產(chǎn)生的抑制作用。對(duì)其胞外產(chǎn)物進(jìn)行熱處理，酸堿處理以

6、及蛋白酶K處理，結(jié)果表明熱處理和蛋白酶K處理可使其活性部分失活，而且隨著飽和硫酸銨沉淀粗蛋白類物質(zhì)的重量增加，其抑菌作用也明顯增強(qiáng)，表明菌株SW-1的胞外產(chǎn)物中含有具有抑菌成分的蛋白類物質(zhì)。酸堿處理結(jié)果表明:胞外產(chǎn)物具有廣泛的pH值適應(yīng)范圍，而且這部分物質(zhì)經(jīng)酸堿處理后，抑菌活性有增強(qiáng)的現(xiàn)象，說(shuō)明菌株SW-1所產(chǎn)生的抑制溶藻弧菌生長(zhǎng)的物質(zhì)并非單一的蛋白類物質(zhì)。
　　 利用飽和度為80％硫酸銨沉淀菌株SW-1的無(wú)菌上清培養(yǎng)液，得到對(duì)

7、文蛤致病弧菌MP-1具有抑制作用的粗蛋白類物質(zhì)，將粗蛋白類物質(zhì)經(jīng)10 KDa的分子篩超濾后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大于10 KDa的部分具有抑菌活性，隨后粗蛋白類物質(zhì)經(jīng)SephadexG-75凝膠過(guò)濾層析洗脫得到三個(gè)特征吸收峰，其中第一、二個(gè)峰蛋白質(zhì)含量較高，成分相對(duì)比較復(fù)雜，但是對(duì)文蛤致病弧菌MP-1沒(méi)有抑菌作用;具有抑菌活性的第三個(gè)峰的蛋白質(zhì)含量為6.1 mg/ml，經(jīng)SDS-PAGE凝膠垂直電泳可得到相對(duì)單一條帶，表明其純度較高，根據(jù)R

8、f值測(cè)其分子量為52.6 KDa。
　　 收集假交替單胞菌SW-1胞外產(chǎn)物，利用三倍的乙酸乙脂進(jìn)行浸提，經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到的浸提膏，在24 h時(shí)，其對(duì)文蛤的致病弧菌MP-1的抑菌率達(dá)到98％以上;經(jīng)有機(jī)溶劑溶解，發(fā)現(xiàn)為極性較大的醇溶性物質(zhì)，在290、330、410 nm處有吸收峰;可以產(chǎn)生多糖類物質(zhì)，紅外光譜圖也表明其具有糖肽吸收峰，采取硅膠柱利用不同比例的二氯甲烷和甲醇進(jìn)行洗脫，得到46餾分，利用薄層層析法進(jìn)行分組合并其效果