溶藻弧菌三種LamB蛋白的交叉免疫原性及其在抗生素脅迫下功能的初步研究.pdf

1、弧菌病是影響海水養(yǎng)殖業(yè)的主要病害之一，現(xiàn)在大部分采用的是化學(xué)藥物及抗生素治療。但是這些治療藥物易殘留，不但對水體環(huán)境產(chǎn)生污染，而且由于藥物的使用不當(dāng)，易產(chǎn)生耐藥性菌株。關(guān)于弧菌病的防治越來越多的趨向于綠色健康化的疫苗。溶藻弧菌是四大類病原弧菌之一，其數(shù)量最多，致病性僅次于副溶血弧菌?；【饽さ鞍资且环N較好的潛在交叉疫苗原，而課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌來源的一種LamB蛋白在弧菌屬中有較好的交叉免疫原性。數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌至少存在三種

2、不同的LamB蛋白，據(jù)此本課題首先主要研究比較三種LamB蛋白在弧菌中的交叉免疫原性，得到的初步結(jié)果如下：
　　首先從本實驗室保存的溶藻弧菌中成功將三種lamB基因克隆、序列分析，發(fā)現(xiàn)三種lamB自身相似性極低，但與已報道的弧菌屬lamB有較高的相似性、并且有多個保守性的抗原表位，這表明三種LamB在弧菌屬中具有交叉免疫原性。通過系統(tǒng)發(fā)育樹比較，LamB3的保守性可能不如LamB1和LamB2。
　　其次進行了三種lamB基

3、因的原核表達及交叉免疫原性研究。與pET-32a(+)質(zhì)粒進行酶連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后目的蛋白以包涵體形式大量存在；經(jīng)NI-NTA純化，對目的蛋白進行驗證后制備抗血清。利用Western-blotting及whole-cell ELISA檢測三種LamB蛋白在弧菌屬種間及種內(nèi)的交叉免疫原性及細胞定位，結(jié)果證實LamB1和LamB2在弧菌屬具有交叉免疫原性，并且抗原表位位于細菌表面能夠被多克隆抗體庫所識別；而LamB3

4、的交叉免疫原性不如LamB1和LamB2，可能需要以交叉免疫保護性進一步驗證。
　　抗生素耐藥性問題已是全球必須面對的嚴峻問題。由于溶藻弧菌對多種抗生素有較高的耐受性，并且據(jù)報道，LamB蛋白差異性表達為革蘭氏陰性菌產(chǎn)生抗生素耐藥性的主要方式之一，因此接下來的實驗主要研究三種LamB蛋白是否在菌株耐藥性產(chǎn)生中發(fā)揮了一定的作用。
　　經(jīng)抗生素反復(fù)誘導(dǎo)，最終得到10種符合抗生素耐受性標(biāo)準(zhǔn)的耐藥菌株。SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)耐受菌株中