牛乳β-乳球蛋白過敏原表位串聯(lián)體的表達.pdf

1、牛乳過敏是一種常見的食物過敏反應(yīng),其中β-乳球蛋白是公認的主要乳過敏原之一,大約82％的牛乳過敏患者對β-乳球蛋白過敏。另外,表位是引發(fā)食物過敏的物質(zhì)基礎(chǔ),對食物過敏原表位的探索是食物過敏研究的重要組成部分。因此,開展牛乳β-乳球蛋白表位的研究具有重要意義。此外,本研究將β-乳球蛋白表位構(gòu)建成表位串聯(lián)體,優(yōu)化組合的串聯(lián)體將具有獨立的抗原性,在基于食物過敏原表位檢測的研發(fā)中具有潛在的應(yīng)用價值。
　　 本論文工作研究內(nèi)容包括牛乳β-

2、乳球蛋白線性表位串聯(lián)體的分子設(shè)計,表位串聯(lián)體在原核系統(tǒng)中的表達及純化,抗表位串聯(lián)體多克隆抗體的制備及表位串聯(lián)體的抗原性和過敏原性評估。研究的主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下:
　　 1.以牛乳β-乳球蛋白與人血清IgE結(jié)合的7個B細胞線性表位(B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7)和1個T細胞表位(T)為研究對象,選擇適當?shù)拈g隔序列將其串聯(lián)。理論上有5040種組合方式。通過DNAStar及SOMPA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器篩選合適的組合方式,使構(gòu)

3、建的串聯(lián)體中各表位具有獨立的抗原性。B細胞表位之間的間隔序列為甘氨酸(G),T細胞與B細胞表位之間的間隔序列是兩個賴氨酸(KK)。最后設(shè)計出的串聯(lián)體分子組合結(jié)構(gòu)為:T-K-K-B1-G-B6-G-B5-G-B3-G-B7-G-B2-G-B4。
　　 2.在設(shè)計好的串聯(lián)體分子兩端分別加上酶切位點BamHI和EcoRI后進行基因合成,合成的基因克隆到載體pMD19-T中。經(jīng)過雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟,成功構(gòu)建了表達載體pGEX-4T

4、-1-串(pGEX-4T-1-tan),并轉(zhuǎn)化到表達菌株E.coliBL21(DE3)pLysS中。
　　 3.構(gòu)建好的載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,表達出的蛋白為串聯(lián)體融合蛋白,分子量約為39.5kD。經(jīng)過SDS-PAGE和Western blotting鑒定,表達結(jié)果正確。同時通過對誘導(dǎo)溫度、時間及IPTG濃度的優(yōu)化,得到目的蛋白可溶性表達的最佳條件為:23℃誘導(dǎo)4h,IPTG濃度為0.3mmol/L。表達的蛋白帶有GST標簽,純

5、化后其蛋白濃度為4mg/ml。
　　 4.以純化的串聯(lián)體融合蛋白為抗原,按常規(guī)的免疫程序?qū)芍蝗毡敬蟀锥眠M行免疫,間接ELISA檢測結(jié)果表明,純化的串聯(lián)體蛋白具有良好的抗原性,日本大白耳兔對其具有很好的免疫應(yīng)答。得到的抗體效價分別1:128,000和1:64,000。通過間接ELISA及免疫印跡實驗,結(jié)果表明本實驗純化的串聯(lián)體蛋白與牛乳β-乳球蛋白存在較強的免疫交叉反應(yīng)。
　　 5.用牛乳過敏患者血清檢測串聯(lián)體融合蛋白