麗蠅抗病毒肽Alloferon1基因串聯(lián)體的構(gòu)建和表達.pdf

1、目的：利用同尾酶構(gòu)建基因同向串聯(lián)體的方法，構(gòu)建Alloferonl基因2串聯(lián)體重組質(zhì)粒，并將其在大腸桿菌中融合表達。為大規(guī)模制備Alloferonl奠定基礎。 方法：根據(jù)瑞士微生物肽數(shù)據(jù)庫(APD)收錄的Alloferonl氨基酸序列，選擇大腸桿菌偏愛密碼子設計并合成該基因序列。利用同尾酶法構(gòu)建同向串聯(lián)體的要求，在目的基因的5’端引入EcoRI酶切后的粘性末端，并在其后引入XbaI的酶切位點；在目的基因的3’端引入SalI酶切后

2、的粘性末端，并在其前引入NheI的酶切位點，同時在XbaI位點后和NheI位點前引入蛋氨酸(Met)密碼子(ATG)，構(gòu)成溴化氰(CNBr)裂解位點。將合成的Alloferonl基因克隆到載體pUC18上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，即可獲得Alloferonl單拷貝工程菌。利用XbaI(T▽CTAGA)與NheI(G▽CTAGC)互為同尾酶的特性，二酶切割后的粘性末端均為CTAG，可以進行連接，但連接后的新序列TCTAGC不被二酶再識別，采

3、用ScaI(pUC18上位于多克隆酶切位點外的一個酶切位點)/XbaI和ScaI/NheI分別雙酶切單拷貝重組質(zhì)粒，回收大片段pUC18-Alloferonl和小片段Alloferonl，進行連接，轉(zhuǎn)化DH5a，用EcoRI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒即可得到Alloferonl 2拷貝串聯(lián)體。將其與pGEX-4T-1表達載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，即可獲得Alloferonl 2拷貝串聯(lián)體工程菌。對IPTG誘導時機、IPTG誘導溫度和

4、IPTG誘導時間等條件進行摸索，最終確定了最佳表達條件：當菌液A600nm≈0.8時加入終濃度為0.5mmol/L IPTG誘導表達4h后，經(jīng)SDS-PAGE電泳觀察融合蛋白得到了可溶性的高效表達。用GSTrapFF 1ml預裝柱手工進行GST融合蛋白的純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳觀察得到了Alloferonl 2拷貝融合蛋白(31KD)。 結(jié)果： 1、按照設計的方案進行操作，獲得了Alloferonl基因2串聯(lián)體，經(jīng)E

5、coRI和SalI雙酶切pGEX-4T-1-(Alloferonl)2重組質(zhì)粒之后，在約110bp處可見一條清晰的DNA條帶，其大小與理論計算值相符。 2、重組的pGEX-4T-1-(Alloferonl)2質(zhì)粒DNA經(jīng)雙脫氧末端終止法測序，結(jié)果證明，本研究構(gòu)建的Alloferonl基因2串聯(lián)體的核苷酸序列和閱讀框完全正確。 3、含重組pGEX-4T-1-(Alloferonl)2的菌液經(jīng)終濃度為0.5mmol/L的IPTG誘導

6、表達后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在37℃誘導表達4h后，在細菌裂解上清中出現(xiàn)了一條Mr約為31×103的新生GST融合蛋白帶，其分子質(zhì)量大小與理論計算值相符。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了Alloferonl基因2串聯(lián)體重組質(zhì)粒，獲得了可成功表達相應目標融合蛋白的2拷貝串聯(lián)體工程菌。對其表達條件進行了優(yōu)化，獲得了具有較高純度的Alloferonl 2拷貝融合蛋白(31KD)，為進一步純化得到Alloferonl單體及其抗病毒活性測定奠