草魚(yú)抗病毒轉(zhuǎn)基因P0代的構(gòu)建和魚(yú)類Chordin基因的克隆及其對(duì)金魚(yú)尾型的影響.pdf

1、目前，魚(yú)類育種領(lǐng)域的一個(gè)重要方向是基因功能和轉(zhuǎn)基因研究。通過(guò)發(fā)掘重要性狀主效基因或其基因型，開(kāi)展基因與性狀關(guān)聯(lián)分析或轉(zhuǎn)基因研究，從而選育出性狀優(yōu)良的新品種，有利于魚(yú)類的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)不斷進(jìn)步與發(fā)展。
　　為探索草魚(yú)抗出血病新技術(shù)，本研究采用衣殼蛋白靶向滅活（Capsid-targeted viral inactivation,CTVI）策略，利用Tgf2轉(zhuǎn)座子元件，構(gòu)建了帶爪蟾EF1α和鯉熱休克蛋白70的2種不同啟動(dòng)子的CTVI轉(zhuǎn)基因質(zhì)

2、粒 pTgf2-EF1α-VP3-SN和pTgf2-Hsp70-VP3-SN。該2種質(zhì)粒均含有草魚(yú)GCRV病毒衣殼蛋白VP3與金黃色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus nuclease,SN)融合表達(dá)閱讀框。通過(guò)將2種CTVI轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒與體外合成的Tgf2轉(zhuǎn)座酶5'加帽 mRNA共同顯微注射入草魚(yú)1-2細(xì)胞期受精卵，獲得了帶2種不同啟動(dòng)子的CTVI轉(zhuǎn)基因草魚(yú)群體。PCR和測(cè)序結(jié)果顯示，2種轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性草魚(yú)基因組中均含有外源GCR

3、V病毒衣殼蛋白VP3與金黃色葡萄球菌核酸酶SN基因片段，陽(yáng)性率分別為40.2％和37.0%，表明Tgf2轉(zhuǎn)座子已成功介導(dǎo)CTVI融合表達(dá)基因整合到草魚(yú)基因組中。本研究共獲得了120尾P0代CTVI轉(zhuǎn)基因個(gè)體草魚(yú)，為將來(lái)構(gòu)建抗出血病草魚(yú)新品系奠定了材料基礎(chǔ)。
　　本文還獲得了團(tuán)頭魴C(jī)hordin基因cDNA的全長(zhǎng)序列。團(tuán)頭魴C(jī)hordin基因全長(zhǎng)為3736bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?829bp，可編碼942個(gè)氨基酸，其中包含18個(gè)氨基酸信號(hào)

4、肽和924個(gè)氨基酸成熟肽。與人類和斑馬魚(yú)一樣，團(tuán)頭魴C(jī)hordin成熟多肽也包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域：CHRD和vWC結(jié)構(gòu)域。團(tuán)頭魴C(jī)hordin與人Chordin、金魚(yú)Chordin A/B和斑馬魚(yú)Chordin的序列相似度分別為68%、89%、88%和68%，由此可見(jiàn)團(tuán)頭魴C(jī)hordin在進(jìn)化上具有很強(qiáng)的保守性。RT-PCR分析結(jié)果表明，團(tuán)頭魴C(jī)hordin基因在不同胚胎時(shí)期具有不同的表達(dá)模式，Chordin基因在0hpf至32hpf表達(dá)量較

5、為恒定，但是從36hpf階段，表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì)；在成魚(yú)團(tuán)頭魴中，Chordin在除外其他組織中都有表達(dá)，在腦中的表達(dá)量最高。整胚原位雜交結(jié)果顯示，在團(tuán)頭魴C(jī)hordin mRNA主要在胚胎的尾部表達(dá)，其中16pdf胚胎表達(dá)量較高。饑餓處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，團(tuán)頭魴C(jī)hordin mRNA在腦中的表達(dá)量呈急劇升高后降低然后又升高漸漸趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)；注射生長(zhǎng)激素處理實(shí)驗(yàn)表明，團(tuán)頭魴C(jī)hordin mRNA在腦中表達(dá)量隨著hGH注射劑量的升高

6、而呈逐漸降低的趨勢(shì)，通過(guò)對(duì)團(tuán)頭魴C(jī)hordin基因的克隆和功能研究進(jìn)一步為團(tuán)頭魴良種的選育奠定了基礎(chǔ)。
　　此外，本論文進(jìn)一步研究了Chordin基因與魚(yú)類尾型（單尾型-雙尾型）性狀的相關(guān)性。對(duì)于魚(yú)類尾鰭性狀決定因子的研究很少有報(bào)道，金魚(yú)作為我國(guó)重要的觀賞性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，其表型性狀尾鰭一直是人工選擇和培育的重要方向。金魚(yú)生長(zhǎng)周期短，但是尾鰭性狀的變異率較大，難以達(dá)到大規(guī)模培育和養(yǎng)殖單一品種的要求。目前，已有研究表明Chordin A基

7、因的突變對(duì)金魚(yú)尾鰭骨骼系統(tǒng)形成、單尾或雙尾表型起著重要的作用。本研究采用分子生物學(xué)方法對(duì)不同品種金魚(yú)及其雜交魚(yú)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Chordin A基因中含有一段18bp的特異堿基核苷酸序列第6為A突變?yōu)镚，16位G突變?yōu)門時(shí)，性狀表現(xiàn)為雙尾鰭，且表型為雙尾鰭的Chordin A基因型一定是雙尾純合位點(diǎn)。在多種魚(yú)中對(duì)這段特異堿基核苷酸序列對(duì)比分析可知，該序列具有較高的保守性。原位雜交對(duì)單、雙尾鰭的比較結(jié)果表明，Chordin A mRNA在

8、單尾鰭胚胎中表達(dá)量高于雙尾鰭，MyoD mRNA在單尾鰭胚胎中信號(hào)由背至尾逐漸減弱，而MyoG mRNA在雙尾鰭中信號(hào)由背至尾逐漸增強(qiáng)，Ntl mRNA在雙尾鰭胚胎中的尾部表達(dá)，Bmp4 mRNA在單、雙尾鰭胚胎中表達(dá)量都很高。通過(guò)CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)Chordin A基因的敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Chordin A基因中的一個(gè)等位基因的突變，受另一等位基因的控制，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了金魚(yú)單、雙尾鰭的形成與卵質(zhì)內(nèi)Chordin A mRN