苦蕎過(guò)敏原共表達(dá)及TBb抗原表位的研究.pdf

1、苦蕎麥作為“藥食同源”的糧食作物，其營(yíng)養(yǎng)成分種類豐富，含量均衡。然而，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥中含有的過(guò)敏性成分通?？墒菇佑|或食用它的人產(chǎn)生過(guò)敏癥狀。而與過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的僅為其抗原決定簇，即能刺激抗體產(chǎn)生的部位（數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)氨基酸），被稱為表位。本實(shí)驗(yàn)室在以往研究的基礎(chǔ)上獲得了一種編碼苦蕎過(guò)敏蛋白全長(zhǎng)的cDNA序列，命名為TBt，并于2006年在GenBank上登錄(登錄號(hào)為DQ849083)。此苦蕎過(guò)敏蛋白TBt由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即N端結(jié)

2、構(gòu)域(TBb)和C端結(jié)構(gòu)域(TBa)，對(duì)N端結(jié)構(gòu)域TBb的研究表明，該過(guò)敏蛋白能與蕎麥過(guò)敏病人血清中的IgE抗體特異性結(jié)合，具有較高的免疫學(xué)活性。
　　本研究根據(jù)已獲得的苦蕎過(guò)敏蛋白N端結(jié)構(gòu)域TBb的氨基酸序列，運(yùn)用DNAStar軟件，綜合分析了TBb的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、可及性、可塑性、抗原性指數(shù)，并預(yù)測(cè)其B細(xì)胞表位的分布。結(jié)果表明，在TBb蛋白的320個(gè)氨基酸殘基中共有11個(gè)表位，分別位于6-17,31-45,50-57,88-

3、94,103-134,138-146,156-163,178-185,192-220,240-260,267-299區(qū)段。為了進(jìn)一步確定預(yù)測(cè)表位區(qū)的免疫學(xué)活性，我們將11個(gè)預(yù)測(cè)表位區(qū)分為四組，分別命名為G1、G2、G3、G4。并根據(jù)TBb的cDNA序列，設(shè)計(jì)引物，克隆了該四個(gè)表位區(qū)段基因，同時(shí)構(gòu)建了四個(gè)原核表達(dá)載體(pQE31-G1、pQE31-G2、pQE31-G3、pQE31-G4)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Ni

4、2+-NTA親和層析純化，分別獲得了純度較高的重組表位區(qū)蛋白。通過(guò)ELISA對(duì)得到的目的蛋白進(jìn)行了免疫學(xué)活性鑒定和比較，初步確定表位區(qū)段G2為苦蕎過(guò)敏原TBb的主要抗原表位。這為進(jìn)一步研究苦養(yǎng)過(guò)敏原TBb的突變體和特異性抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。
　　為了揭示全長(zhǎng)苦蕎過(guò)敏蛋白兩個(gè)亞基TBa和TBb之間的相互關(guān)系，本研究將實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的兩個(gè)表達(dá)載體pET-28a-TBa和pET-32m-TBb，同時(shí)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，利用