苦蕎16kD過敏原基因啟動子的克隆及功能分析.pdf

1、蕎麥富含蛋白質和多種黃酮類物質，食用和藥用價值較高，苦蕎引發(fā)的過敏反應日益受到重視?？嗍w16kD過敏原(TBW16)是引起苦蕎過敏癥狀的原因之一。本研究克隆并分析了TB W16啟動子序列，將啟動子融合β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因用基因槍法轟入苦蕎外植體瞬時表達研究其組織特異性。從5'端進行啟動子截短，將各段啟動子缺失片融合熒光素酶轉入苦蕎葉片原生質體瞬時表達以測定其活性，并根據各片段上相應的激素元件對啟動子進行脅迫處理，研究其對激素調

2、控的響應規(guī)律。該研究對揭示TBW16啟動子的組織特異性和基因在苦蕎中的代謝調控機制及其生物學功能具有重要意義。另外，本研究對TBW16基因的組織特異性進行了分析，并構建了TB W16基因的干擾和過表達載體，分別轉化苦蕎和擬南芥，從分子生物學途徑開展TBW16基因沉默和過表達，對進一步研究TBW16的功能和消除過敏原、改良苦蕎有重要意義。結論如下:
　　(1)實時定量分析TBW16基因在苦蕎莖、根、葉和種子中的表達量，結果表明該基因

3、在苦蕎種子中大量表達，在苦蕎根、葉、莖中表達量較低。初步判定該基因的啟動子為種子特異性啟動子。
　　(2)利用基因組步移法獲得1876bpTBW16啟動子序列，經生物信息學分析發(fā)現其具有以下啟動子基本元件:轉錄起始位點（-38bp）、TATA-box(-72bp)、CAAT-box(-50);三種激素響應元件:2個茉莉酸甲酯響應元件(TGACG-motif,-1584bp;CGTCA-motif,-1407bp)、2個赤霉素響應元

4、件(GARE-motif,-198bp、-1815bp)和1個脫落酸響應元件(ABRE，-156bp);兩個種子特異性元件(RY-repeat,-92bp、-134bp)。
　　(3)TBW16全長啟動子構建重組載體TB W16P-pCAPMB IA1301，用基因槍法將重組質粒轉入苦蕎外植體根、莖、葉和種子中并啟動β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因瞬時表達，被轟擊的外植體經GUS染色后觀察表明，種子中

5、GUS的表達量最高，葉片中有微量GUS表達，苦蕎的根和莖中均無肉眼可見的GUS表達。
　　(4)將全長啟動子進行5'端缺失形成4段啟動子分析片段，并分別構建截短啟動子的重組雙熒光報告載體GP-TBW16P1、GP-TB W16P2、GP-TBW16P3和GP-TBW16P4。分別將4種重組載體轉入苦蕎葉片原生質體中進行瞬時表達，結果顯示在TBW16啟動子上存在調節(jié)基因轉錄的區(qū)域，約位于-1564bp至-1876bp。報告基因在GA