水產(chǎn)品主要過敏原毛細(xì)管電泳檢測方法的建立及抗原表位的研究.pdf

1、近年來，水產(chǎn)品及其制品引起的過敏問題日益嚴(yán)重。由于微量水產(chǎn)品過敏原即可引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，建立快速、準(zhǔn)確的水產(chǎn)品過敏原檢測方法，標(biāo)示水產(chǎn)制品中過敏原含量，具有降低水產(chǎn)品過敏發(fā)病率的重要意義。目前，水產(chǎn)品過敏原常用檢測以ELISA法和PCR法為代表，但這兩種方法存在成本高、操作繁瑣、對水產(chǎn)制品檢測準(zhǔn)確度低的缺點(diǎn)。基于上述問題，本研究旨在研究出一種結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便、成本低的水產(chǎn)品過敏原檢測方法。同時(shí)，本論文采用生物信息學(xué)方法對南美白對蝦和

2、鯉魚主要過敏原的抗原表位進(jìn)行了預(yù)測分析和驗(yàn)證。主要內(nèi)容如下:
　　1、建立了毛細(xì)管區(qū)帶電泳測定甲殼類水產(chǎn)品中原肌球蛋白含量的方法。通過研究緩沖體系的濃度、pH、分離電壓等條件對分離的影響，得到了電泳的最優(yōu)條件:在214nm波長處，分離電壓為15 kV，25 mmol/L硼酸-硼砂緩沖液(pH=9.2)運(yùn)行緩沖液下，原肌球蛋白在5 min內(nèi)得到分離檢測。在上述優(yōu)化條件下，在5～100μg/mL范圍，原肌球蛋白的質(zhì)量濃度和電泳峰面積線

3、性良好，線性回歸方程為y=16968.06x+65072.35，線性相關(guān)系數(shù)為0.993，檢出限(S/N=3)為3.83μg/mL。原肌球蛋白的加標(biāo)回收率在91％～103％之間，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.5％（n=6）。該方法簡便快速、靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于測定甲殼類水產(chǎn)品中原肌球蛋白的含量。
　　2、建立了毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測魚類過敏原小清蛋白含量的方法。經(jīng)過條件優(yōu)化，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件為:檢測波長是214 nm，分離電壓為1

4、5 kV，運(yùn)行緩沖液是30 mmol/L硼酸-硼砂緩沖溶液(pH=9.2)。在5～100μg/mL范圍內(nèi)，小清蛋白的質(zhì)量濃度和電泳峰面積線性良好，線性回歸方程為y=16464.68x+38102.39，線性相關(guān)系數(shù)為0.994，檢出限(S/N=3)為2.31μg/mL，小清蛋白在5 min內(nèi)得到分離檢測。小清蛋白的加標(biāo)回收率在91％～116％之間，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差7.4％(n=6)。該方法可用于測定魚類過敏原小清蛋白的含量。

5、>　　3、采用生物信息學(xué)軟件對21種甲殼類原肌球蛋白進(jìn)行序列對比，結(jié)果表明，原肌球蛋白是高保守性蛋白，具有較高的同源性。其次，采用DNAStar和AntheProt軟件對南美白對蝦主要過敏原（原肌球蛋白）氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，預(yù)測得到并合成10條表位多肽。并采用IC-ELISA方法，利用10位蝦致敏患者血清對10條表位多肽的活性進(jìn)行初步驗(yàn)證。結(jié)果顯示，8條表位多肽對患者血清表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力，其中，2條表位分布在原肌球蛋白氨基酸

6、序列的非保守區(qū)，且其中1條未包含在已被報(bào)道的其他蝦類原肌球蛋白的表位中。在8條表位區(qū)域中，谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)出現(xiàn)頻率較高，有可能是影響Lit v1過敏原性的關(guān)鍵氨基酸。
　　4、采用生物信息學(xué)軟件對19種魚類小清蛋白進(jìn)行序列對比，結(jié)果表明，魚類小清蛋白同源性較高，是高保守性蛋白。采用DNAStar和AntheProt軟件對鯉魚過敏原（小清蛋白）兩個(gè)亞型的線性表位

7、進(jìn)行研究。經(jīng)過預(yù)測分析，兩個(gè)亞型各預(yù)測得到、合成5個(gè)表位多肽。采用IC-ELISA方法，利用10位魚致敏患者血清對10條表位多肽的活性進(jìn)行初步驗(yàn)證。結(jié)果顯示，Cyp c1.01和Cyp c1.02各有3條表位多肽對魚致敏患者血清表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力，且在兩個(gè)亞型蛋白中，有兩條表位多肽未包含在已被報(bào)道的小清蛋白表位中。對表位區(qū)域進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果表明，Cyp c1.01中，丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、賴氨酸(L