2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本課題采用滅活的O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌為抗原,通過雜交瘤技術(shù)制備針對霍亂弧菌的單克隆抗體,并通過一步法配對篩選技術(shù)平臺得到2株高特異性高活性的O1群小川型霍亂弧菌單抗IXiao<,3>G<,6>和IXiao<,1>D<,9>,并以此為基礎(chǔ)研制成功O1群小川型霍亂的膠體金試紙條,為臨床霍亂病例診斷、高危人群監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查及衛(wèi)生檢疫等提供快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測手段。在此基礎(chǔ)上以IXiao<,3>G<,6>單抗為靶標(biāo),應(yīng)

2、用噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)進(jìn)行了霍亂弧菌模擬肽篩選,通過對篩選出的模擬肽(mimic peptide,MP)基因優(yōu)化設(shè)計(jì),實(shí)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù),構(gòu)建含模擬肽與霍亂毒素B亞單位(CTB)編碼基因嵌合表達(dá)的重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌BL21中表達(dá),鑒定其抗原性,為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的開發(fā)與設(shè)計(jì)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分霍亂弧菌單克隆抗體的制備及篩選 目的:制備并篩選出高特異性高活性的抗霍亂弧菌單克隆抗體(McAb),為霍亂的預(yù)防診斷

3、提供有力的抗體工具。 方法:以滅活的O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌免疫Balb/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù)制備針對霍亂弧菌的McAb,以間接ELISA法對所需的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行第一輪篩選,除了用O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌的菌體抗原進(jìn)行特異性篩選外,還選用了多種包括弧菌科及其他常見細(xì)菌在內(nèi)的菌體抗原進(jìn)行排除性篩選。第二輪篩選采用獨(dú)特的“單抗金標(biāo)平行快速篩選技術(shù)”建立單克隆抗體細(xì)胞株配對篩選技術(shù)平臺,將純化單抗標(biāo)

4、記膠體金和包被硝酸纖維素膜后兩兩組合配對篩選。 結(jié)果:用間接ELISA經(jīng)特異性初篩,共篩選出602株能分泌抗O1群小川型霍亂弧菌單抗、386株能分泌抗O1群稻葉型霍亂弧菌單抗、82株能分泌抗O139群霍亂弧菌單抗的雜交瘤細(xì)胞株。此后重復(fù)進(jìn)行間接ELISA特異性篩選及交叉反應(yīng)篩選,得到15株只分泌抗O1群小川型霍亂弧菌的特異性McAb、15株只分泌抗O1群稻葉型霍亂弧菌的特異性McAb、10株只分泌抗O139群霍亂弧菌的特異性Mc

5、Ab的細(xì)胞株。經(jīng)配對篩選,最后篩選出兩株只針對O1群小川型霍亂弧菌高特異性高活性的單抗:X8(IXiao<,3>G<,6>)和X2(IXiao<,1>D<,9>)。 結(jié)論:獲得兩株只針對O1群小川型霍亂弧菌高特異性高活性的McAb,為O1群小川型霍亂早期快速診斷和預(yù)防的研究提供基礎(chǔ)。 第二部分特異性O(shè)1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體的鑒定及應(yīng)用 目的:本部分我們首先對所獲得的2株只針對O1群小川型霍亂弧菌的單抗細(xì)胞株

6、IXiao<,3>G<,6>和,IXiao<,1>D<,9>進(jìn)行理化性質(zhì)的鑒定和生物學(xué)特性的研究,然后用這2株單抗研制O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測卡,建立以單克隆抗體為基礎(chǔ)的雙抗夾心法膜式超靈敏膠體金快速檢測方法,用于霍亂的早期診斷。 方法:首先對篩選到的高特異性的兩株單抗進(jìn)行了分離、純化及鑒定:先通過飽和硫酸銨鹽析的方法粗提抗體,再用Protein A親和層析法進(jìn)一步純化,然后對單抗進(jìn)行了包括染色體分析,亞型鑒定,效價(jià)、

7、親和常數(shù)的測定以及特異性的鑒定與分析,并通過單克隆抗體的位點(diǎn)相加實(shí)驗(yàn)、與O1群小川型霍亂弧菌LPS的間接ELISA和westernblot實(shí)驗(yàn)對兩株單抗識別的抗原表位進(jìn)行了初步研究。然后采用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)及膠體金標(biāo)記技術(shù),通過雙抗體夾心法(抗體-抗原-抗體),以2株單抗作為包被及標(biāo)記抗體,制備膠體金.抗體結(jié)合物和反應(yīng)膜,研制霍亂弧菌膠體金快速檢測卡,并通過特異性、靈敏度、重復(fù)性及穩(wěn)定性的檢測進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。 結(jié)果:SD

8、S-PAGE結(jié)果表明,純化后單抗純度達(dá)95%以上,經(jīng)鑒定兩株單抗亞類分別為IgG<,2b>及IgG<,3>,特異性好、親和力高(親和常數(shù)為10<'9>)、效價(jià)高(腹水效價(jià)均達(dá)10<'-6>),對兩株單抗識別的抗原表位進(jìn)行初步研究表明兩株單抗針對的是不同抗原表位,IXiao<,3>G<,6>針對O1群小川型霍亂弧菌脂多糖,而IXiao<,1>D<,9>針對非脂多糖抗原位點(diǎn)。制備了O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測試紙卡,實(shí)現(xiàn)對O1群小川型

9、霍亂弧菌菌體抗原的特異檢測,建立了單克隆抗體夾心法-膠體金試紙條檢測霍亂弧菌的方法,初步試驗(yàn)結(jié)果證明,該法具有很好的特異性(100%)和靈敏度(最低檢出量1×10<'4>cfu/ml),重復(fù)性100%,穩(wěn)定性好(室溫保存一年也不失活),檢測時(shí)間快(5分鐘可判定結(jié)果),操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。 結(jié)論:對篩選到的高特異性的兩株單抗進(jìn)行分離、純化及鑒定,進(jìn)一步證實(shí)這兩株單抗達(dá)到了診斷用抗體親和力的要求,對下步模擬表位的篩選及獲得能誘導(dǎo)保護(hù)性免

10、疫反應(yīng)的模擬肽也有重要的應(yīng)用價(jià)值。O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測卡能夠特異檢測O1群小川型霍亂弧菌,操作簡單,結(jié)果判定清晰可靠,解決了現(xiàn)霍亂檢測中無法對小川及稻葉型區(qū)別檢測的問題,彌補(bǔ)了國內(nèi)國際霍亂檢測試劑盒的一個(gè)缺口和空白點(diǎn),為臨床診斷、食品安全檢測、環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測、反恐和出入境檢疫等提供有效的檢測手段。 第三部分O1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體識別表位模擬肽的篩選鑒定 目的:以純化的有高度特異性的IXiao<,3>G

11、<,6>單抗為靶分子,對噬菌體隨機(jī)7肽庫進(jìn)行淘篩,以期篩選到與O1群小川型霍亂弧菌單抗有高親和力的模擬肽,為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 方法:運(yùn)用噬菌體隨機(jī)七肽庫技術(shù),以純化的IXiao<,,3>G<,6>單抗為靶蛋白,進(jìn)行噬菌體隨機(jī)肽庫3輪篩選,以雙抗夾心ELISA和競爭抑制試驗(yàn)分析獲得的噬菌體短肽與篩選配基的結(jié)合能力及特異性,并進(jìn)行陽性克隆序列測定和同源性分析。 結(jié)果:三輪篩選后,陽性噬菌體得到有

12、效富集,夾心ELISA檢測隨機(jī)挑取的25個(gè)噬菌體克隆,有22個(gè)噬菌體克隆為陽性,測序表明其中20個(gè)陽性克隆的氨基酸序列完全一致,均為APAIPAS。對該序列同源性分析,未發(fā)現(xiàn)有相同的已知序列。競爭抑制試驗(yàn)表明,O1群小川型霍亂弧菌LPS能很好地抑制陽性克隆與IXiao<,3>G<,6> McAb的結(jié)合,抑制程度隨LPS濃度的升高而增加,而對照細(xì)菌的LPS則不具有相應(yīng)的抑制作用,進(jìn)一步提示噬菌體克隆展示肽模擬了O1群小川型霍亂弧菌LPS抗

13、原表位。 結(jié)論:篩選到模擬O1群小川型霍亂弧菌LPS的抗原表位的模擬肽,為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的開發(fā)與設(shè)計(jì)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第四部分O1群小川型霍亂弧菌模擬肽與霍亂毒素B亞單位的重組表達(dá)及抗原性分析 目的:對篩選的模擬O1群小川型霍亂弧菌LPS抗原表位的MP基因?qū)崿F(xiàn)串聯(lián)重復(fù),構(gòu)建含MP與霍亂毒素B亞單位(CTB)編碼基因的重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌BL21中表達(dá),鑒定其抗原性,為進(jìn)一步研制基于表位的霍亂弧菌

14、模擬多肽疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法:用PCR方法擴(kuò)增CTB目的基因片段,經(jīng)Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ雙酶切后,與進(jìn)行同樣酶切處理的質(zhì)粒pET32a(+)在T4連接酶的作用下連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,通過鑒定、測序,構(gòu)建pET32a(+)-CTB重組質(zhì)粒。根據(jù)獲得的O1群小川型霍亂弧菌LPS模擬表位對應(yīng)的基因序列,設(shè)計(jì)寡核苷酸鏈,實(shí)現(xiàn)MP基因的串聯(lián)重復(fù),經(jīng)PCR得到模擬肽的核苷酸鏈,克隆至重組質(zhì)粒pET32a(+)-CTB的CTB基因

15、下游,構(gòu)建含嵌合基因的重組質(zhì)粒pET32a(+)-CTB-MP,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE30),通過IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),Ni-NTA.試劑盒純化目的蛋白,用間接ELISA、western-blot檢測其抗原性,用競爭抑制試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證MP是否模擬了O1群小川型霍亂弧菌LPS的抗原表位,還應(yīng)用ELISA檢測CTB與單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM-1的結(jié)合。 結(jié)果:實(shí)現(xiàn)了串聯(lián)重復(fù)的O1群小川型霍亂弧菌LPS模擬肽(MP)與CTB的重組,

16、SDS-PAGE顯示,IPTG誘導(dǎo)后CTB和CTB-MP蛋白均獲得高效表達(dá),相對分子量分別為32KD和34KD,與預(yù)期相符,目的蛋白純化后純度可達(dá)90%以上。間接ELISA、western-blot檢測表明CTB-MP融合蛋白可與IXiao<,3>G<,6>單抗結(jié)合,競爭抑制試驗(yàn)表明CTB-MP可抑制IXiao<,3>G<,6>單抗與O1群小川型霍亂弧菌及O1群小川型霍亂弧菌LPS的結(jié)合,通過ELISA表明CTB與單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM

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