日本血吸蟲抱雌溝蛋白相互作用因子的篩選及SjActin與SjTWF的研究.pdf

1、血吸蟲病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布，由血吸蟲感染引起的危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。血吸蟲為吸蟲中獨(dú)特的雌雄異體形式，雌雄蟲的合抱是血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵，抱雌溝蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種在雌雄蟲合抱過程中進(jìn)行傳遞的蛋白質(zhì)。所以對(duì)抱雌溝蛋白及其相互作用蛋白的研究，對(duì)了解血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理具有重要的意義
　　 一、抱雌溝蛋白相互作用因子的篩選。
　　 利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的誘餌蛋白-血吸蟲抱雌溝蛋白重組質(zhì)粒pGBKT7-BD-S

2、jGCP與成功構(gòu)建的18日齡日本血吸蟲酵母雙雜交cDNA預(yù)轉(zhuǎn)化文庫進(jìn)行抱雌溝蛋白相互作用因子的篩選。對(duì)篩選出的383個(gè)陽性文庫質(zhì)粒的外源插入片段進(jìn)行序列測(cè)定得到131個(gè)外源插入序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，除去重復(fù)序列，共得到45個(gè)不同的有效基因序列。將得到的基因序列重新構(gòu)建到pGADT7-AD載體上，與pGBK-BD-SjGCP進(jìn)行回復(fù)雜交驗(yàn)證其相互作用，去除假陽性后得到了16個(gè)與血吸蟲抱雌溝蛋白相互作用的蛋白的基因序列。本試驗(yàn)在篩選

3、過程中采取了反復(fù)傳代，并對(duì)陽性克隆進(jìn)行回復(fù)雜交驗(yàn)證，保證了假陽性的去除，得到的16個(gè)蛋白經(jīng)分析表明其有充分的與抱雌溝蛋白作用的可能性，但這些相互作用尚需進(jìn)一步采取其他方式驗(yàn)證。
　　 二、日本血吸蟲Actin及Twinfilin蛋白的初步研究。
　　 為研究酵母雙雜交所篩選出與SjGCP相互作用的SjACT和SjTWF蛋白，本文首先構(gòu)建了這兩種蛋白的重組表達(dá)載體，并在大腸桿菌中獲得大量的原核表達(dá)產(chǎn)物。Westren-bl

4、ot方法證實(shí)了表達(dá)出的蛋白具有良好的免疫原性，并且發(fā)現(xiàn)篩選出的SjActin蛋白為肌動(dòng)蛋白家族中的Smooth Muscle Actin(SMA，Actin-α2)蛋白。利用抗SMA蛋白的單抗及SjGCP的多抗進(jìn)行的激光共聚焦熒光共定位實(shí)驗(yàn)表明這兩種蛋白在空間上都定位在血雌蟲表膜上，從而證實(shí)了酵母雙雜交篩選的可靠性。由Real-time方法分析SjActin和SjTWF在血吸蟲發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)SjActin和SjTWF的轉(zhuǎn)錄

5、分別在血吸蟲感染宿主后的23和21天較高。對(duì)SjTWF蛋白的免疫反應(yīng)類型分析發(fā)現(xiàn)，免疫鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IFN-γ量在SjTWF刺激后明顯升高，差異極顯著(P＜0.001)，而脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10量在SjTWF刺激前后都比較高，之間沒有顯著差異(P＞0.05)，產(chǎn)生IL-4的量在SjTWF刺激后升高(P＜0.05)。這說明SjTWF即刺激機(jī)體產(chǎn)生ThⅠ類型的免疫反應(yīng)，也刺激機(jī)體產(chǎn)生ThⅡ類型的免疫反應(yīng)。
　　 三、RN

6、A干擾日本血吸蟲Actin，Twinfilin蛋白的研究。
　　 為更進(jìn)一步確定SjACT和SjTWF在血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程中所起的作用，本文分別設(shè)計(jì)三對(duì)小RNA分子干擾體外培養(yǎng)血吸蟲的SjACT和SjTWF蛋白表達(dá)。對(duì)干擾前后SjACT和SjTWF基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的分析發(fā)現(xiàn)干擾獲得成功，且發(fā)現(xiàn)干擾效果最佳的小分子干擾該蛋白的表達(dá)引起較高的血吸蟲死亡率。對(duì)小RNA分子干擾對(duì)血吸蟲形態(tài)影響的觀察發(fā)現(xiàn)SjACT和SjTWF蛋