日本血吸蟲(chóng)性別差異蛋白質(zhì)組及抱雌溝蛋白基因功能研究.pdf

1、本論文針對(duì)此特點(diǎn)開(kāi)展了日本血吸蟲(chóng)性別差異蛋白質(zhì)組和雄蟲(chóng)特異性表達(dá)的抱雌溝蛋白基因的功能研究，以探索血吸蟲(chóng)雌雄蟲(chóng)合抱、發(fā)育成熟的分子機(jī)理，開(kāi)拓免疫預(yù)防新途徑。 一、關(guān)于日本血吸蟲(chóng)性別差異蛋白質(zhì)組研究。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)首次對(duì)日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、童蟲(chóng)(14天)、成熟雌蟲(chóng)和成熟雄蟲(chóng)的可溶性蛋白、疏水性蛋白和膜蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)分離，構(gòu)建了各自的高分辨率雙向電泳圖譜。表明蟲(chóng)卵、童蟲(chóng)、成熟雌蟲(chóng)和成熟雄蟲(chóng)在可溶性蛋白組份分別分離到1016±6

2、7，1808±89，1142±45和1288±32個(gè)蛋白斑點(diǎn)；在疏水性蛋白組份分別分離到1425±108，952±59，847±75和965±69個(gè)蛋白斑點(diǎn)；在膜蛋白組份分別分離到78±3、67±3、108±4和122±4個(gè)蛋白斑點(diǎn)。比較分析獲得合抱后雌雄成蟲(chóng)特異呈現(xiàn)的性別差異蛋白質(zhì)譜，雌雄成蟲(chóng)分別獨(dú)特呈現(xiàn)23±2和41±4個(gè)可溶性蛋白斑點(diǎn)；26±3和¨±1個(gè)疏水性蛋白斑點(diǎn)；4和5個(gè)膜蛋白斑點(diǎn)。鑒定了28個(gè)合抱后雌雄成蟲(chóng)特異呈現(xiàn)的蛋白。

3、結(jié)果提示參與細(xì)胞間信息傳遞的信號(hào)分子、參與基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯調(diào)控分子和參與代謝酶類(lèi)、發(fā)育調(diào)節(jié)因子等在合抱后雌雄蟲(chóng)呈現(xiàn)表達(dá)差異。本研究為深入揭示雌雄蟲(chóng)合抱后蟲(chóng)體的發(fā)育、雌蟲(chóng)成熟產(chǎn)卵的機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)，對(duì)開(kāi)發(fā)新的疫苗候選抗原和藥物靶標(biāo)具有重要價(jià)值。 二、關(guān)于日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白基因的功能研究。抱雌溝蛋白為血吸蟲(chóng)雄蟲(chóng)特異性表達(dá)，在與其合抱的雌蟲(chóng)體表廣泛分布一種性別特異性蛋白。本論文利用RNA干擾技術(shù)對(duì)抱雌溝蛋白基因的功能進(jìn)行了研究。

4、根據(jù)日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)dsRNA分子(s1，s2，s3)并分別按低和高濃度(50nM和200nM)加入培養(yǎng)體系以干擾抱雌溝蛋白基因的表達(dá)。利用RT-PCR、Westernblotting和免疫熒光分析證明能顯著抑制抱雌溝蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，可高達(dá)84％。又分析了dsRNA分子干擾的劑量效應(yīng)，結(jié)果表明dsRNA分子(s1)抑制抱雌溝蛋白基因具有劑量依賴(lài)性，當(dāng)dsRNA分子終濃度為100nM作用7天時(shí)，抱雌溝蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平

5、降低75％。對(duì)蟲(chóng)體雌雄蟲(chóng)合抱效應(yīng)的觀察表明，干擾后雌雄合抱受到不同程度的影響，其中兩個(gè)高濃度干擾組(s1，s2)的合抱現(xiàn)象完全受到抑制。利用掃描電子顯微鏡分析合抱完全受到抑制的雄蟲(chóng)抱雌溝表膜結(jié)構(gòu)，與對(duì)照組相比其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)瘠的間斷，瘠間隙大和刺短的變化。進(jìn)一步利用cDNA微陣列對(duì)干擾抱雌溝蛋白基因后引起的蟲(chóng)體相關(guān)基因表達(dá)變化進(jìn)行了初步探索，結(jié)果顯示參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子功能的基因呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)、能量和離子代謝及應(yīng)激蛋白等基因呈

6、現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。通過(guò)上述研究發(fā)現(xiàn)抱雌溝蛋白基因具有影響血吸蟲(chóng)雌雄蟲(chóng)合抱功能，本論文結(jié)果也是國(guó)內(nèi)外首次明確某種物質(zhì)能影響雌雄蟲(chóng)的合抱，對(duì)于開(kāi)拓抗血吸蟲(chóng)生殖發(fā)育新途徑的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐應(yīng)用具有重要意義。采用尾靜脈動(dòng)態(tài)注射技術(shù)將dsRNA分子導(dǎo)入到血吸蟲(chóng)感染的小鼠體內(nèi)。結(jié)果表明在動(dòng)物體內(nèi)血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)明顯降低，雌雄蟲(chóng)的合抱受到顯著抑制。據(jù)作者查詢(xún)所知，這是在動(dòng)物個(gè)體水平上實(shí)現(xiàn)利用RNAi技術(shù)成功干擾血吸蟲(chóng)基因功能的首例，揭示了基因