藥物(PZQ)壓力下日本血吸蟲(chóng)的耐藥性誘導(dǎo)及抗血吸蟲(chóng)新藥的篩選.pdf

1、目的：
　　 1日本血吸蟲(chóng)吡喹酮耐藥蟲(chóng)體的篩選及其超微結(jié)構(gòu)的觀察
　　 2體外實(shí)驗(yàn)觀察地西泮類衍生物(B3，B30，B3-O2，B3-2O2)和五羥色胺/多巴胺受體拮抗劑（利培酮，奧氮平，喹硫平）的抗血吸蟲(chóng)效應(yīng)。
　　 方法：
　　 (1)動(dòng)物模型建立：按常規(guī)逸尾蚴方法獲得日本血吸蟲(chóng)尾蚴，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染單只陽(yáng)性釘螺逸出的日本血吸蟲(chóng)尾蚴（單性）60±2條。
　　 (2)血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的獲得：頸椎

2、脫臼處死小鼠，肝門靜脈灌注法收集成蟲(chóng)，將采集的活的雄性成蟲(chóng)置于DMEM培養(yǎng)液中，每皿6條，放入37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中。
　　 (3)體外培養(yǎng)的血吸蟲(chóng)活力評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：3分：蟲(chóng)體活躍、體態(tài)柔和、顏色呈透明狀；2分：活動(dòng)度略差，蟲(chóng)體稍僵硬、顏色呈半透明狀；1分：蟲(chóng)體僅頭端或尾端活動(dòng)輕微，蟲(chóng)體僵硬呈白色；0分：完全死亡。
　　 (4)應(yīng)用本課題組測(cè)定的PZQ ED50(20.89mg/kg/只)作為亞治療劑量，以七種不同誘導(dǎo)

3、時(shí)間[5d、10d、20d、30d、60d、90d(1次/d)和10d(1次/2d)]對(duì)成蟲(chóng)期日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體進(jìn)行藥物壓力下的耐藥性篩選。
　　 (5)應(yīng)用PZQ ED50對(duì)感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴3w和6w后小鼠喂飼連續(xù)給藥30d，肝門靜脈灌注法收集雄性成蟲(chóng)，加入不同濃度PZQ連續(xù)培養(yǎng)5d，觀察蟲(chóng)體活力變化。
　　 (6)成蟲(chóng)期蟲(chóng)體誘導(dǎo)30d后再經(jīng)治療劑量PZQ連續(xù)喂飼給藥5d，體外培養(yǎng)觀察蟲(chóng)體對(duì)藥物的敏感性變化。
　　

4、 (7)收集日本血吸蟲(chóng)雄性成蟲(chóng)，加入不同濃度地西泮類衍生物(B3，B30，B3-O2，B3-2O2)和五羥色胺/多巴胺受體拮抗劑（利培酮、奧氮平、富馬酸喹硫平）連續(xù)培養(yǎng)5d，觀察蟲(chóng)體活力并影像記錄。
　　 (8)掃描電鏡觀察蟲(chóng)體超微結(jié)構(gòu)的變化：收集培養(yǎng)48h后的日本血吸蟲(chóng)，用生理鹽水(PH7.4)沖洗3遍，放入4%戊二醛固定過(guò)夜，0.1M的磷酸鹽緩沖液沖洗兩次，每次10min;1%的鋨酸固定1h;30%、50%、70%、80%

5、、90%叔丁醇依次脫水，每次10min，100%叔丁醇脫水三次，放入-20℃過(guò)夜；IB-5真空離子濺射鍍膜機(jī)鍍金，送入S570掃描電鏡（日本EDAX公司）觀察。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成蟲(chóng)期日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體經(jīng)PZQ ED50以不同誘導(dǎo)時(shí)間作用后，隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，所篩選到的蟲(chóng)體對(duì)藥物的敏感性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，連續(xù)用藥30d后的蟲(chóng)體對(duì)PZQ的敏感性降低最顯著，表明30d是適宜的誘導(dǎo)時(shí)間。
　　 (2)感染6w的成蟲(chóng)

6、期和感染3w的童蟲(chóng)期蟲(chóng)體經(jīng)PZQ ED50連續(xù)誘導(dǎo)30d后，體外培養(yǎng)，蟲(chóng)體對(duì)PZQ的敏感性均顯著下降，童蟲(chóng)期蟲(chóng)體經(jīng)誘導(dǎo)后對(duì)PZQ的敏感性下降更顯著。掃描電鏡觀察誘導(dǎo)后蟲(chóng)體的體表、抱雌溝與正常未誘導(dǎo)蟲(chóng)體相比損傷輕微，特別是童蟲(chóng)期誘導(dǎo)后蟲(chóng)體超微結(jié)構(gòu)損傷程度更小。
　　 (3)日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)經(jīng)藥物篩選后再用治療劑量(200mg/kg)PZQ連續(xù)給藥5d后，體外培養(yǎng)觀察顯示，蟲(chóng)體在不同濃度PZQ作用下存活率仍達(dá)100%，掃描電鏡顯示體表

7、、抱雌溝損害比單純用藥30d的蟲(chóng)體輕。
　　 (4)地西泮類衍生物B3和B30在藥物濃度為50μmol/L時(shí)，在體外可以導(dǎo)致日本血吸蟲(chóng)完全死亡；五羥色胺/多巴胺受體拮抗劑利培酮對(duì)日本血吸蟲(chóng)有一定的殺蟲(chóng)效應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)在持續(xù)藥物壓力下，感染宿主體內(nèi)不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)可能對(duì)吡喹酮產(chǎn)生一定的耐受性，可篩選出耐藥蟲(chóng)體，特別是在感染早期(3w)的童蟲(chóng)階段，在藥物壓力下更易于產(chǎn)生耐受性，為臨床用藥提供實(shí)