釀酒酵母高爾基體糖基化及生物學功能的研究.pdf

1、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有無毒、容易培養(yǎng)、遺傳背景清晰和對外源蛋白有糖基化修飾等優(yōu)點，是理想的外源蛋白表達宿主。釀酒酵母是第一個完成基因組測序的真核生物，酵母基因組數(shù)據(jù)庫關于酵母基因組的詳細注釋(annotation)是研究糖基化酶的結(jié)構與功能之間的關系，尋找關鍵的結(jié)構域及闡明這些與膜相連的糖基化酶的拓撲學(topography)結(jié)構的重要工具。由于定位于釀酒酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的糖基化酶基因基本已

2、被分離，有目的性的敲除這些酶將促進闡明糖基化與細胞功能的機制。在真核細胞中，分泌蛋白和定位蛋白經(jīng)常被復雜的寡糖鏈修飾，糖蛋白中的寡糖在許多細胞識別過程中起著重要作用，如腫瘤轉(zhuǎn)移、細胞粘附、病原體入侵和免疫反應等。另外，糖基化影響蛋白質(zhì)的生物合成、折疊、抗原性、免疫原性及其在血漿中的半衰期。釀酒酵母蛋白N-糖基化和其他真核生物一樣，首先發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，N-連接的寡糖轉(zhuǎn)移至新生肽的天冬酰胺上。轉(zhuǎn)運到定位之前，N-糖鏈還經(jīng)過高爾基體中進一步修

3、飾加工至成熟的糖鏈結(jié)構。本課題主要研究了酵母高爾基體糖基化過程及N-糖鏈outer chain在細胞生命過程中的生物學功能。 Mnnlp和Ochlp是釀酒酵母高爾基體糖基化過程中的起始階段的兩個甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，Mnnlp參與N-糖鏈outer chain形成α1，3-甘露糖，Ochlp則在核心糖鏈Man<,8>GlcNAc<,2>上加上一個α1，6-甘露糖，從而引發(fā)outer'chain的α1，6-backbone的形成和N-糖

4、鏈的過度甘露糖基化。利用Overlap extension PCR的方法，我們在體外構建了等位基因敲除DNA片段。通過敲除DNA片段上的同源序列與酵母基因組發(fā)生重組置換，敲除酵母N-糖基化過程中的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因MNNl和OCHl，構建了兩株蛋白糖基化突變菌株：mnnl突變菌株和mnnl ochl 突變菌株。為分析mnnl ochl突變菌株蛋白的糖基化形式，我們采用熱檸檬酸抽提的方法，提取了酵母細胞壁的甘露糖蛋白；利用高甘露糖親和柱c

5、oncanavalin A-sepharose 4B親和層析純化抽提液中的甘露糖蛋白。利用糖酰胺酶PNGase F水解釋放糖蛋白中的糖鏈；采用Shim-pack clc-NH2氨基柱Size-fractionation HPLC分析了2-氨基吡啶衍生后的糖鏈組份，結(jié)果表明，mnnlochl突變菌株蛋白的糖鏈為單一組成，該組分的MALDI TOF/MS分子量鑒定為1794.66Da，與Man<,8>GlcNAc<,2>-PA的分子量相同。

6、結(jié)果說明了MNNl和OCHl基因的敲除阻斷了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核心糖鏈(ER core type glycan)在高爾基體中形成高聚合度甘露糖的outer chain，在mnnl ochl突變菌株中蛋白糖基化是單一的核心糖鏈結(jié)構，Man<,8>GlcNAc<,2>。糖蛋白不僅是細胞結(jié)構的重要組成部分，也是細胞生命活動的主要承擔者之一。在mnnl ochl，突變菌株中，蛋白糖基化在高爾基體階段修飾受阻，通過突變菌株細胞形態(tài)及生化特征觀察，發(fā)現(xiàn)高爾基體

7、糖基化缺陷影響了細胞一些正常的活動；比較野生型和mnnl ochl突變菌株的生長曲線，發(fā)現(xiàn)突變菌株細胞生長速度明顯減慢，菌體密度也不高；通過溫度敏感性實驗和臺盼藍染色(trypan blue dye staining)考察了高爾基體糖基化突變對細胞活力的影響。結(jié)果表明單個敲除基因MNNl并不影響細胞的生長表型，如果同時敲除MNNl和OCHl基因后，突變菌株的生長對溫度變得敏感，這種溫度敏感性的生長依賴于滲透壓穩(wěn)定劑。在mnnl ochl

8、突變菌株中，細胞還表現(xiàn)一些細胞分裂的缺陷，而且滲透壓穩(wěn)定劑也不能抑制突變菌株細胞分裂缺陷。高爾基體糖基化突變影響了新生細胞壁的形成，導致子細胞不能正常地從母體細胞分離出來，細胞的不完全分裂造成了mnnl ochl突變菌株生長高度聚集，細胞堆積。另外，高爾基體糖基化缺陷也影響到分裂過程中細胞核的遷移，對mnnl ochl突變菌株細胞的細胞核DAPI染色發(fā)現(xiàn)一些芽孢沒有細胞核。mnnl ochl突變使得N-糖鏈的完全喪失outer chai

9、n，因此減少了Ⅳ-糖鏈的甘露糖磷酸化位點，這減弱細胞與細胞之間相同電荷的排斥作用，也破壞細胞表面的水化層，從而影響細胞的粘度，導致mnnl ochl細胞易堆積沉降。 細胞凋亡(apoptosis)的生物學意義主要在于清除多余的、有害及衰老細胞，這一機制仍然保留在單細胞生物中。在哺乳動物和酵母中，蛋白整個糖基化過程缺陷，如ER糖基化起始階段的基因突變或糖基化抑制劑，都誘導細胞的凋亡。本研究結(jié)果表明，N-連接糖鏈的不完整(高爾基體糖

10、基化缺陷)足夠引發(fā)酵母糖基化誘導的細胞凋亡。在trypan blue staining分析mnnl ochl突變菌細胞活力時發(fā)現(xiàn)，37℃培養(yǎng)時細胞大量死亡，顯微觀察發(fā)現(xiàn)部分死亡的細胞呈現(xiàn)與衰老細胞(ageing cell)相似的表征，如細胞表面疏松，皺褶。對mnnl ochl突變菌的凋亡形態(tài)學和生物化學特征進一步考察，結(jié)果顯示，死亡的細胞中呈現(xiàn)細胞染色質(zhì)濃縮(chromatin condensation)，胞核碎化(nuclear fr

11、agmentation)，磷脂酰絲氨酸外露(phosphatidylserine exposure)在細胞膜的外層，而細胞膜保持完整，這些細胞凋亡表型及生化的特征表明，mnnl ochl，突變菌株細胞經(jīng)歷了程序性死亡過程(programme cell death)?；钚匝踝杂苫?reactive oxygenspecies，ROS)是酵母細胞凋亡關鍵的調(diào)控子，利用熒光探針二氫羅丹明123(dihydrorhodamine 123)檢測m

12、nnl ochl突變菌株細胞內(nèi)的ROS水平，結(jié)果顯示，在28℃和37℃培養(yǎng)的細胞中，ROS都出現(xiàn)不同程度的積累，說明高爾基體糖基化缺陷誘導的細胞凋亡是通過ROS途徑進行調(diào)控。高爾基體糖基化缺陷可破壞酵母細胞壁的結(jié)構完整性，導致大量細胞壞死(necrosis)，這一點通過mnnl ochl突變菌株增加了對50μg/ml的剛果紅(Congo red)和細胞壁水解酶glucuronidase-Iyticase敏感性以及1.0M的山梨醇(sor

13、bitol)提高了細胞存活率中得到證實。人干擾素-β(HuIFN-β)是成纖維細胞受病毒感染或誘生劑誘導產(chǎn)生的細胞因子，廣泛應用抗病毒，多發(fā)性硬化和腫瘤化療。HulFN-β是糖蛋白，在Asn<'80>上有一個N-I糖基化位點。將HulFN-β基因?qū)脶劸平湍阜置谛捅磉_載體pYFDl8，構建重組載體pYFDl8-HulFN，通過電擊轉(zhuǎn)化法，將重組載體分別導入w3031A(wild type)菌株，mnnl突變菌株及mnnl，ochl突變菌

14、株，篩選轉(zhuǎn)化子并表達外源蛋白，利用Western blot檢測酵母細胞內(nèi)和發(fā)酵液中的HuIFN-β的表達，結(jié)果顯示，HuIFN-β蛋白在胞內(nèi)積累，都沒有在α-factor信號肽的引導下分泌到發(fā)酵液中。而且野生型和mnnl ochl突變菌株的Westem blot雜交條帶大-小相同，由此證明，β-干擾素在釀酒酵母中表達時，由于對酵母細胞的毒性，沒有經(jīng)過分泌途徑進入高爾基體進行糖基化修飾而分泌到胞外，從而造成HulFN-β以α-factor