釀酒酵母高爾基體糖基化及生物學(xué)功能的研究.pdf

1、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有無毒、容易培養(yǎng)、遺傳背景清晰和對(duì)外源蛋白有糖基化修飾等優(yōu)點(diǎn)，是理想的外源蛋白表達(dá)宿主。釀酒酵母是第一個(gè)完成基因組測序的真核生物，酵母基因組數(shù)據(jù)庫關(guān)于酵母基因組的詳細(xì)注釋(annotation)是研究糖基化酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，尋找關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域及闡明這些與膜相連的糖基化酶的拓?fù)鋵W(xué)(topography)結(jié)構(gòu)的重要工具。由于定位于釀酒酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的糖基化酶基因基本已

2、被分離，有目的性的敲除這些酶將促進(jìn)闡明糖基化與細(xì)胞功能的機(jī)制。在真核細(xì)胞中，分泌蛋白和定位蛋白經(jīng)常被復(fù)雜的寡糖鏈修飾，糖蛋白中的寡糖在許多細(xì)胞識(shí)別過程中起著重要作用，如腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞粘附、病原體入侵和免疫反應(yīng)等。另外，糖基化影響蛋白質(zhì)的生物合成、折疊、抗原性、免疫原性及其在血漿中的半衰期。釀酒酵母蛋白N-糖基化和其他真核生物一樣，首先發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，N-連接的寡糖轉(zhuǎn)移至新生肽的天冬酰胺上。轉(zhuǎn)運(yùn)到定位之前，N-糖鏈還經(jīng)過高爾基體中進(jìn)一步修

3、飾加工至成熟的糖鏈結(jié)構(gòu)。本課題主要研究了酵母高爾基體糖基化過程及N-糖鏈outer chain在細(xì)胞生命過程中的生物學(xué)功能。 Mnnlp和Ochlp是釀酒酵母高爾基體糖基化過程中的起始階段的兩個(gè)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，Mnnlp參與N-糖鏈outer chain形成α1，3-甘露糖，Ochlp則在核心糖鏈Man<,8>GlcNAc<,2>上加上一個(gè)α1，6-甘露糖，從而引發(fā)outer'chain的α1，6-backbone的形成和N-糖

4、鏈的過度甘露糖基化。利用Overlap extension PCR的方法，我們?cè)隗w外構(gòu)建了等位基因敲除DNA片段。通過敲除DNA片段上的同源序列與酵母基因組發(fā)生重組置換，敲除酵母N-糖基化過程中的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因MNNl和OCHl，構(gòu)建了兩株蛋白糖基化突變菌株：mnnl突變菌株和mnnl ochl 突變菌株。為分析mnnl ochl突變菌株蛋白的糖基化形式，我們采用熱檸檬酸抽提的方法，提取了酵母細(xì)胞壁的甘露糖蛋白；利用高甘露糖親和柱c

5、oncanavalin A-sepharose 4B親和層析純化抽提液中的甘露糖蛋白。利用糖酰胺酶PNGase F水解釋放糖蛋白中的糖鏈；采用Shim-pack clc-NH2氨基柱Size-fractionation HPLC分析了2-氨基吡啶衍生后的糖鏈組份，結(jié)果表明，mnnlochl突變菌株蛋白的糖鏈為單一組成，該組分的MALDI TOF/MS分子量鑒定為1794.66Da，與Man<,8>GlcNAc<,2>-PA的分子量相同。

6、結(jié)果說明了MNNl和OCHl基因的敲除阻斷了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核心糖鏈(ER core type glycan)在高爾基體中形成高聚合度甘露糖的outer chain，在mnnl ochl突變菌株中蛋白糖基化是單一的核心糖鏈結(jié)構(gòu)，Man<,8>GlcNAc<,2>。糖蛋白不僅是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分，也是細(xì)胞生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者之一。在mnnl ochl，突變菌株中，蛋白糖基化在高爾基體階段修飾受阻，通過突變菌株細(xì)胞形態(tài)及生化特征觀察，發(fā)現(xiàn)高爾基體

7、糖基化缺陷影響了細(xì)胞一些正常的活動(dòng)；比較野生型和mnnl ochl突變菌株的生長曲線，發(fā)現(xiàn)突變菌株細(xì)胞生長速度明顯減慢，菌體密度也不高；通過溫度敏感性實(shí)驗(yàn)和臺(tái)盼藍(lán)染色(trypan blue dye staining)考察了高爾基體糖基化突變對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明單個(gè)敲除基因MNNl并不影響細(xì)胞的生長表型，如果同時(shí)敲除MNNl和OCHl基因后，突變菌株的生長對(duì)溫度變得敏感，這種溫度敏感性的生長依賴于滲透壓穩(wěn)定劑。在mnnl ochl

8、突變菌株中，細(xì)胞還表現(xiàn)一些細(xì)胞分裂的缺陷，而且滲透壓穩(wěn)定劑也不能抑制突變菌株細(xì)胞分裂缺陷。高爾基體糖基化突變影響了新生細(xì)胞壁的形成，導(dǎo)致子細(xì)胞不能正常地從母體細(xì)胞分離出來，細(xì)胞的不完全分裂造成了mnnl ochl突變菌株生長高度聚集，細(xì)胞堆積。另外，高爾基體糖基化缺陷也影響到分裂過程中細(xì)胞核的遷移，對(duì)mnnl ochl突變菌株細(xì)胞的細(xì)胞核DAPI染色發(fā)現(xiàn)一些芽孢沒有細(xì)胞核。mnnl ochl突變使得N-糖鏈的完全喪失outer chai

9、n，因此減少了Ⅳ-糖鏈的甘露糖磷酸化位點(diǎn)，這減弱細(xì)胞與細(xì)胞之間相同電荷的排斥作用，也破壞細(xì)胞表面的水化層，從而影響細(xì)胞的粘度，導(dǎo)致mnnl ochl細(xì)胞易堆積沉降。 細(xì)胞凋亡(apoptosis)的生物學(xué)意義主要在于清除多余的、有害及衰老細(xì)胞，這一機(jī)制仍然保留在單細(xì)胞生物中。在哺乳動(dòng)物和酵母中，蛋白整個(gè)糖基化過程缺陷，如ER糖基化起始階段的基因突變或糖基化抑制劑，都誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果表明，N-連接糖鏈的不完整(高爾基體糖

10、基化缺陷)足夠引發(fā)酵母糖基化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在trypan blue staining分析mnnl ochl突變菌細(xì)胞活力時(shí)發(fā)現(xiàn)，37℃培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞大量死亡，顯微觀察發(fā)現(xiàn)部分死亡的細(xì)胞呈現(xiàn)與衰老細(xì)胞(ageing cell)相似的表征，如細(xì)胞表面疏松，皺褶。對(duì)mnnl ochl突變菌的凋亡形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征進(jìn)一步考察，結(jié)果顯示，死亡的細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞染色質(zhì)濃縮(chromatin condensation)，胞核碎化(nuclear fr

11、agmentation)，磷脂酰絲氨酸外露(phosphatidylserine exposure)在細(xì)胞膜的外層，而細(xì)胞膜保持完整，這些細(xì)胞凋亡表型及生化的特征表明，mnnl ochl，突變菌株細(xì)胞經(jīng)歷了程序性死亡過程(programme cell death)?；钚匝踝杂苫?reactive oxygenspecies，ROS)是酵母細(xì)胞凋亡關(guān)鍵的調(diào)控子，利用熒光探針二氫羅丹明123(dihydrorhodamine 123)檢測m

12、nnl ochl突變菌株細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，結(jié)果顯示，在28℃和37℃培養(yǎng)的細(xì)胞中，ROS都出現(xiàn)不同程度的積累，說明高爾基體糖基化缺陷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過ROS途徑進(jìn)行調(diào)控。高爾基體糖基化缺陷可破壞酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致大量細(xì)胞壞死(necrosis)，這一點(diǎn)通過mnnl ochl突變菌株增加了對(duì)50μg/ml的剛果紅(Congo red)和細(xì)胞壁水解酶glucuronidase-Iyticase敏感性以及1.0M的山梨醇(sor

13、bitol)提高了細(xì)胞存活率中得到證實(shí)。人干擾素-β(HuIFN-β)是成纖維細(xì)胞受病毒感染或誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，廣泛應(yīng)用抗病毒，多發(fā)性硬化和腫瘤化療。HulFN-β是糖蛋白，在Asn<'80>上有一個(gè)N-I糖基化位點(diǎn)。將HulFN-β基因?qū)脶劸平湍阜置谛捅磉_(dá)載體pYFDl8，構(gòu)建重組載體pYFDl8-HulFN，通過電擊轉(zhuǎn)化法，將重組載體分別導(dǎo)入w3031A(wild type)菌株，mnnl突變菌株及mnnl，ochl突變菌

14、株，篩選轉(zhuǎn)化子并表達(dá)外源蛋白，利用Western blot檢測酵母細(xì)胞內(nèi)和發(fā)酵液中的HuIFN-β的表達(dá)，結(jié)果顯示，HuIFN-β蛋白在胞內(nèi)積累，都沒有在α-factor信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌到發(fā)酵液中。而且野生型和mnnl ochl突變菌株的Westem blot雜交條帶大-小相同，由此證明，β-干擾素在釀酒酵母中表達(dá)時(shí)，由于對(duì)酵母細(xì)胞的毒性，沒有經(jīng)過分泌途徑進(jìn)入高爾基體進(jìn)行糖基化修飾而分泌到胞外，從而造成HulFN-β以α-factor