利用具備N-糖基化途徑的家蠶細胞系表達糖基化蛋白研究.pdf

1、昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)以其效率高、周期短、成本低的優(yōu)點，自其介導的外源基因表達首次被報道以來，已有近千種外源蛋白在該系統(tǒng)中得以成功表達.設想如果可以將昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的蛋白質(zhì)應用于生產(chǎn)、生活和臨床中，必將具有重大現(xiàn)實意義.但是，隨著研究的深入?yún)s發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)存在一定缺陷，主要表現(xiàn)在昆蟲/昆蟲細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)往往不具備復雜的蛋白質(zhì)糖鏈.然而，在翻譯之后可以直接發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)很少，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)需要修飾后才能發(fā)揮其生物學功能，并且

2、糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最重要的之一.因此對昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)的改進的關注點主要集中在了增加其表達的糖基化蛋白的復雜程度，使其產(chǎn)生生物功能和活性類似于哺乳動物的糖蛋白。
　　 本研究是在胡嘉彪等獲得的轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞4種糖基轉(zhuǎn)移酶基因的家蠶BmN轉(zhuǎn)基因細胞的基礎上，通過酶活檢測以及糖基化蛋白表達和糖型鑒定的方法來驗證轉(zhuǎn)基因細胞的功能。在酶活檢測方面，比較了正常BmN細胞和轉(zhuǎn)基因細胞的beta-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(Ga

3、lT)活性.在糖蛋白表達和檢測方面，利用正常BmN細胞和轉(zhuǎn)基因細胞分別表達糖基化蛋白—人丁酰膽堿酯酶（hBchE），并利用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)檢測細胞總糖糖型，來比較兩種細胞的差異，以達到驗證其糖基化作用的目的。
　　 結(jié)果表明本實驗室所構(gòu)建的含人源性糖?；富虻霓D(zhuǎn)基因家蠶細胞系，經(jīng)過傳代15代，細胞系生長良好，狀態(tài)正常，呈梭型，貼壁好，轉(zhuǎn)基因細胞在紫外光下可見綠色熒光;測定轉(zhuǎn)基因細胞中