糖基化在KSHV編碼vGPCR中的功能研究.pdf

1、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV，又被稱為人類第8型皰疹病毒/HHV-8)是卡波氏肉瘤(KS)、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(PEL)和多中心性巨大淋巴結(jié)增生癥(Multicentric Castleman's Disease)的病因。KSHV編碼的G蛋白耦聯(lián)受體(簡稱vGPCR)為七次跨膜的膜蛋白受體。vGPCR可激活磷脂酶C通路、PI3激酶/蛋白激酶等下游信號組分，在培養(yǎng)細胞中可激活NFκB，NFAT和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)vGPCR基因小鼠

2、可形成類似人類卡波氏肉瘤的病變。本工作組的前期工作表明，翻譯后的調(diào)控對于vGPCR的信號傳導(dǎo)和致瘤性具有至關(guān)重要的意義。蛋白質(zhì)的糖基化是在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)，和蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。糖基化是對蛋白的重要的修飾作用，有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能作用。本工作組發(fā)現(xiàn)vGPCR具有糖基化修飾作用;在此基礎(chǔ)上以HEK293T細胞和Hela細胞為試驗材料，通過vGPCR糖基化突變體構(gòu)建、免疫熒光分析和昆蟲熒光素報告基因檢測等途徑對

3、vGPCR的糖基化進行了較為系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明糖基化對于vGPCR的細胞內(nèi)分布和信號傳導(dǎo)等具有至關(guān)重要的作用。本論文研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下:
　　 1.對vGPCR進行的Endo H蛋白酶切實驗結(jié)果顯示vGPCR具有典型的糖基化現(xiàn)象，并分析vGPCR在第18位、第22位、第31位或第202位天門冬酰胺(asparagine/N)可能具有N-糖基化修飾。
　　 2.以FRT/TO-cDNA5載體和CDH-CMV-Link

4、er載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了vGPCR及其糖基化突變體重組質(zhì)粒:只含有第18位、第22位、第31位或第202位天門冬酰胺的突變體(分別命名為N18、N22、N31和N202);第18位、第22位、第31位或第202位天門冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０罚╣lutamine/Q）的突變體（分別命名為N18Q、N22Q、N31Q和N202Q），以及第18位、第22位、第31位和第202位天門冬酰胺全部突變?yōu)楣劝滨０返耐蛔凅w(N0)。
　　 3.對vGP

5、CR及其糖基化突變體的蛋白進行了免疫印跡雜交檢測，結(jié)果表明vGPCR單個位點突變體和三個位點突變體均具有糖基化修飾現(xiàn)象，而N0不具有有糖基化修飾。
　　 4.對vGPCR及其糖基化突變體進行了免疫熒光檢測，結(jié)果表明vGPCR及其突變體N18、N22、N31、N202、N18Q、N22Q、N31Q都可以在細胞膜上得到表達而N202Q和N0沒有上膜現(xiàn)象。
　　 5.對vGPCR及其糖基化突變體進行了熒光素報告基因?qū)嶒?，實驗結(jié)

6、果表明vGPCR及其突變體N18、N22、N31、N202、N18Q、N22Q、N31Q能上調(diào)NFAT和NFκB的表達，而N202Q和N0不能上調(diào)NFAT和NFκB的表達。
　　 6.制備了含有vGPCR及其糖基化突變體慢病毒，分別用這些慢病毒侵染NIH3T3細胞，并篩選、建立了穩(wěn)定表達vGPCR及其糖基化突變體的NIH3T3細胞系。
　　 綜上所述，本研究證明vGPCR具有糖基化修飾，該糖基化修飾對于vGPCR的信號傳