OGT供體底物識別機(jī)制及其自身O-GlcNAc糖基化修飾功能的研究.pdf

1、O-GlcNAc糖基化修飾是一種動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，廣泛存在于植物和動物中，能夠影響蛋白的催化活性、亞細(xì)胞定位以及與其他蛋白之間的相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝等重要的細(xì)胞生理活動，與多種慢性疾病相關(guān)。
　　O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)負(fù)責(zé)催化O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的發(fā)生。在人體內(nèi)，OGT有三種亞型，即ncOGT、mOGT和sOGT，其結(jié)構(gòu)的主要差異在于N末端TPR序列數(shù)目不同。由于三種亞型C末端催化結(jié)

2、構(gòu)域是完全相同的，因此其催化機(jī)制以及其與糖基供體的識別機(jī)制也應(yīng)是相同的。因此在本課題中，我們選取了較為容易表達(dá)的sOGT作為研究對象，首先對其底物特異性進(jìn)行了研究。以CK(II)十七肽為受體底物，我們探索sOGT對26種UDP-GlcNAc衍生物的催化活性。其中，UDP-6-deoxy-GlcNAc、UDP-GlcNPr、UDP-6-deoxy-GalNAc和UDP-4-deoxy-GlcNAc四種化合物能夠作為sOGT的供體底物。進(jìn)一

3、步對其中三種化合物的酶學(xué)常數(shù)的測定表明，UDP-GlcNAc糖基基團(tuán)的C2位乙酰氨基上的取代、C6和C4位羥基的脫氧取代以及C4位羥基的異構(gòu)都會削弱sOGT與供體底物的親合力。通過OGT與底物的分子對接，并經(jīng)定點突變驗證，我們發(fā)現(xiàn)sOGT的Leu653的羰基氧和Thr560位的羥基能夠與GlcNAc的C4/C6-OH形成氫鍵;Met501與UDP-GlcNAc的C2位乙酰氨基間的空間較小，不能容納體積較大的取代基團(tuán)，而其附近的疏水環(huán)境也

4、利于疏水性取代基團(tuán)的進(jìn)入。上述結(jié)論為進(jìn)一步了解OGT與糖基供體的相互作用以及其催化機(jī)制有一定幫助。
　　已有研究表明，OGT也可以作為自身催化O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的底物，被糖基化修飾?；贠-GlcNAc修飾的功能，我們認(rèn)為OGT的自身糖基化參與了對OGT功能的調(diào)控。
　　本課題運用多種生物學(xué)和化學(xué)研究方法對OGT的自身糖基化修飾現(xiàn)象進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了6個糖基化位點(S10，T12，S18，T38，S52，T449，

5、T662)，定點突變結(jié)果證實其中三個糖基化位點(S18，T38，T449)對sOGT糖基化水平有顯著影響。通過對過表達(dá)的sOGT在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的分布及糖基化水平的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)sOGT的糖基化水平更高。通過激光共聚焦顯微鏡對不同sOGT突變體的亞細(xì)胞定位進(jìn)行觀察，與野生型相比較，發(fā)現(xiàn)T449A和T662A兩個突變體轉(zhuǎn)運入核明顯減少，而其它突變體變化不大，這表明T449和T662兩個位點可能與sOGT轉(zhuǎn)運入核相關(guān)。通過Pull do