BMAL1的O-GlcNAc修飾在晝夜節(jié)律中的作用研究.pdf

1、目的:
　　生物體的睡眠/覺醒、進(jìn)食等行為以及各種生理、生化、代謝過程遵循著大約24小時(shí)的周期性變化，稱為晝夜節(jié)律(circadian rhythms)，其廣泛存在于光敏感的生物中。從調(diào)節(jié)低等生物，如藍(lán)藻的光合作用，到影響哺乳動(dòng)物的進(jìn)食行為，晝夜節(jié)律與能量代謝之間存在著緊密的聯(lián)系。機(jī)體能量代謝如何調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律系統(tǒng)的分子機(jī)制至今并不明確，我們的研究旨在探討蛋白質(zhì)氧連β-N-乙酰葡糖胺修飾(O-linked β-N-acetlgluo

2、samine，O-GlcNAcylation)是否在調(diào)節(jié)機(jī)體晝夜節(jié)律系統(tǒng)中發(fā)揮作用，從而為闡明能量代謝如何調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律提供新的線索。
　　方法:
　　哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律系統(tǒng)的分子模型是以轉(zhuǎn)錄因子CLOCK、BMAL1所組成的異源二聚體為核心的轉(zhuǎn)錄、翻譯反饋環(huán)路。利用實(shí)時(shí)晝夜節(jié)律性光度分析技術(shù)，我們在體外NIH3T3細(xì)胞中檢測蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾抑制劑DON對于細(xì)胞內(nèi)節(jié)律基因表達(dá)的影響。
　　琥珀酰麥胚凝集素(sWG

3、A)可以特異性富集被O-GlcNAc修飾的蛋白，在sWGA富集NIH3T3內(nèi)源性蛋白時(shí)，我們利用不同節(jié)律蛋白抗體檢測哪些節(jié)律蛋白可以被富集。同時(shí)，利用特異性識別糖基化蛋白的抗體CTD110.6檢測免疫沉淀得到的節(jié)律蛋白是否能夠被O-GlcNAc修飾。利用免疫共沉淀和GST pull down技術(shù)檢測節(jié)律蛋白與催化蛋白質(zhì)糖基化的酶OGT之間是否存在相互作用。
　　利用放線菌酮抑制細(xì)胞內(nèi)新蛋白合成，檢測細(xì)胞內(nèi)節(jié)律蛋白在O-GlcNAc

4、修飾被抑制時(shí)，穩(wěn)定性是否改變。
　　利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測O-GlcNAc修飾減弱時(shí)，CLOCK/BMAL1異源二聚體轉(zhuǎn)錄活性是否改變;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測此時(shí)其下游節(jié)律基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.DON處理細(xì)胞后，實(shí)時(shí)晝夜節(jié)律性光度測定發(fā)現(xiàn)節(jié)律基因的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞節(jié)律衰減加快;
　　2.sWGA特異性富集到核心節(jié)律蛋白BMAL1;免疫沉淀得到的BMAL1蛋白節(jié)律性地被O-GlcNAc修飾，其修飾程

5、度隨著OGA過表達(dá)降低，OGT過表達(dá)增高;
　　3.免疫共沉淀及GST pull down實(shí)驗(yàn)檢測到BMAL1與OGT之間存在相互作用;
　　4.DON處理細(xì)胞或過表達(dá)OGA時(shí)，BMAL1蛋白穩(wěn)定性降低;
　　5.DON處理細(xì)胞或過表達(dá)OGA時(shí)，CLOCK/BMAL1蛋白轉(zhuǎn)錄活性降低，下游基因表達(dá)減弱。
　　結(jié)論:
　　1.核心節(jié)律蛋白BMAL1可以被O-GlcNAc修飾并具有節(jié)律性;
　　2.O-G