蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾研究的方法探討.pdf

1、氧連接的氮乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修飾是普遍存在于哺乳動(dòng)物中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。自1984年發(fā)現(xiàn)這種修飾以來(lái),大量的研究證明O-GlcNAG修飾對(duì)蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、活性、穩(wěn)定性等有重要影響,對(duì)蛋白質(zhì)的功能具有不可替代的調(diào)節(jié)作用。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)1000多種蛋白質(zhì)具有O-GlcNAc修飾,這些蛋白質(zhì)參與幾乎所有的生理過(guò)程。O-GlcNA修飾的異常與癌癥、糖尿病和心血管疾病等密切相關(guān)。直接調(diào)節(jié)O-GlcNAc修飾的酶只有兩種,即將

2、UDP-GlcNAc上的GlcNAc修飾到蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸上的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(OGT)和將O-GlcNAc從蛋白質(zhì)上去除的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)。
　　O-GlcNAc修飾在生理和病理過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用,因此O-GlcNAc修飾已受到眾多生命科學(xué)領(lǐng)域研究人員的關(guān)注。然而目前O-GlcNAc修飾的研究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于磷酸化、乙?；头核鼗绕渌g后修飾,這是因?yàn)镺-GlcNAc修飾具備化學(xué)計(jì)量水平低、糖

3、苷鍵不牢固、修飾具有動(dòng)態(tài)性和靶蛋白多為低豐度蛋白等多種特殊性質(zhì),為其研究方法的建立帶來(lái)不便。因此,目前O-GlcNAc修飾研究的方法亟待完善。木文主要針對(duì)O-GlcNAc修飾的蛋白質(zhì)的獲得和O-GlcNAc修飾位點(diǎn)的確定這兩個(gè)O-GlcNAc修飾研究的重要問(wèn)題進(jìn)行了方法探討。
　　要闡明O-GlcNAc修飾對(duì)蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制,獲得大量具有O-G1cNAc修飾的蛋白質(zhì)至關(guān)重要。然而在真核細(xì)胞獲得的O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)

4、會(huì)有磷酸化修飾等其它翻譯后修飾的干擾,不利于研究O-GlcNAc修飾的功能,并且要從真核細(xì)胞中獲得大量具有高度O-GlcNAc修飾的蛋白質(zhì)成本很高,這成為研究O-GlcNAc修飾功能的難題。所以,在原核細(xì)胞和體外對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行O-GlcNAc修飾將是解決這一問(wèn)題的有效途徑。
　　為了建立重組蛋白在原核細(xì)胞中O-GlcNAc修飾的方法,本文以可以被O-GlcNAc高度修飾的Spl作為陽(yáng)性蛋白,將Spl與OGT在大腸桿菌BL21(DE3

5、)中共表達(dá),驗(yàn)證了在原核表達(dá)系統(tǒng)中Spl可以進(jìn)行O-GlcNAc修飾,從而建立了重組蛋白在原核細(xì)胞中進(jìn)行O-GlcNAc修飾的方法。連環(huán)蛋白p120在生理活動(dòng)中扮演著多種角色,對(duì)與癌癥相關(guān)的細(xì)胞活性(細(xì)胞粘連、活力、形態(tài)和生長(zhǎng))有重要影響。木實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)p120的O-GlcNAc修飾在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。因此本文利用建立的重組蛋白在原核細(xì)胞中進(jìn)行O-GlcNAc修飾的方法對(duì)p120進(jìn)行了修飾。結(jié)果表明,這種方法

6、可以成功地應(yīng)用于p120。但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與真核細(xì)胞中p120相比原核細(xì)胞中p120的O-GlcNAc修飾水平較低,因此,本文對(duì)原核細(xì)胞中p120的O-GlcNAc修飾的方法進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間、改變多種鹽離子成分和含量、改變營(yíng)養(yǎng)成分或加入葡萄糖及其類似物對(duì)p120 O-GlcNAc修飾程度都沒(méi)有顯著影響。因?yàn)閁DP-GleNAc的濃度、0GT的濃度和反應(yīng)體系對(duì)蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾水平有重要影響,而在原核細(xì)胞中對(duì)這

7、幾項(xiàng)因素進(jìn)行優(yōu)化比較困難,因此我們推測(cè)將靶蛋白和OGI、進(jìn)行重組表達(dá)和純化后在體外對(duì)靶蛋白進(jìn)行O-GlcNAc會(huì)有效解決這些問(wèn)題。我們以Spl為陽(yáng)性蛋白建立了重組蛋白在體外O-GlcNAc修飾的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,此方法也可以成功地應(yīng)用于p120,且p120在體外的O-GlcNAc修飾水平顯著高于原核細(xì)胞中p120的O-GlcNAc修飾水平。
　　確定蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾位點(diǎn)對(duì)于闡明O-GlcNAc修飾對(duì)蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)作用

8、及機(jī)制是必須的。目前,質(zhì)譜法以其簡(jiǎn)便性和可靠性成為確定O-GlcNAc修飾位點(diǎn)的酋選方法。本文第二章便對(duì)質(zhì)譜法確定O-GlcNAc修飾位點(diǎn)的方法進(jìn)行了初步探討?！?br>　　本文要建立的確定O-GlcNAc修飾位點(diǎn)的質(zhì)譜法流程如下:純化的蛋白質(zhì)經(jīng)胰酶酶解成肽段后,將半胱氨酸上的巰基用氧化或烷基化的方式封閉,再經(jīng)BEMAD(B消除和DTT的邁克爾加成)將O-GlcNAe修飾替換成DTT修飾,最后用硫醇柱富集具有DTT修飾的肽段并質(zhì)譜檢測(cè)。

9、本文對(duì)質(zhì)譜樣品的前處理過(guò)程依次考察,確定了封閉半胱氨酸的方式、BEMAD的條件和BEMAD結(jié)合硫醇柱富集的可行性。從而為本實(shí)驗(yàn)室利用質(zhì)譜法確定O-GlcNAc修飾位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。綜上所述,本文分別對(duì)O-GlcNAc修飾的蛋白質(zhì)的制備和質(zhì)譜法確定O-GlcNAc修飾位點(diǎn)方法進(jìn)行了研究,建立了重組蛋白在原核細(xì)胞和體外O-GlcNAc修飾的方法,初步確定了質(zhì)譜法確定O-GlcNAc修飾位點(diǎn)的樣品處理?xiàng)l件。本文的研究將為O-GlcNAc修飾的研