A20蛋白質O-GlcNAc修飾對大鼠主動脈平滑肌細胞炎癥反應應答的影響及機制.pdf

1、目的：
　　本研究旨在探討A20的O-GlcNAc（氧連-N-乙酰葡萄糖胺）修飾對NF-κB信號通路的調節(jié)效應，闡明細胞內蛋白質O-GlcNAc修飾對A20活性的影響及其在抗炎效應中的作用，從而明確蛋白質O-GlcNAc修飾提供血管保護效應的關鍵靶點。
　　方法：
　　(1)分別給予大鼠主動脈平滑肌細胞(rat aortic smooth muscle cells，RASMCs)轉染空載體腺病毒（AD-NULL）、攜帶

2、A20消減基因的腺病毒(AD-shA20-2)以及攜帶A20過表達基因的腺病毒(AD-A20-IRES)后，再給予Thiamet-G(150nmol/ml)預處理1小時，接著給予TNF-α（10ng/ml）處理6小時，提取RNA樣本，采用real-time RT-PCR檢測炎癥因子MCP-1、P-selectin的mRNA表達。
　　(2)分別給予RASMCs轉染AD-NULL、AD-shA20-2及AD-A20-IRES后，給予

3、Thiamet-G預處理(150nmol/ml)1小時，隨后將細胞接種在Boyden小室上腔，下腔注入含有TNF-α（10ng/ml）的DMEM，繼續(xù)孵育24小時，細胞經固定、染色、漂洗，隨機選擇10個視野計數(shù)遷移至小室底面的細胞數(shù)量。
　　(3)分別給予RASMCs轉染AD-NULL、AD-shA20-2及AD-A20-IRES，接種至96孔板，饑餓細胞，給予Thiamet-G（150nmol/ml）預處理1小時，再給予10％F

4、BS孵育24小時，采用CCK8試劑盒檢測細胞的增殖情況。
　　結果：
　　(1)在轉染AD-NULL的RASMCs，Thiamet-G預處理快速提高細胞O-GlcNAc修飾水平能夠顯著抑制TNF-α誘導的炎癥因子MCP-1、P-selectin表達;在轉染AD-shA20-2的RASMCs，A20蛋白表達明顯減少，而Thiamet-G預處理不再能夠抑制TNF-α誘導的炎癥因子表達;轉染AD-A20-IRES可顯著增加A20蛋

5、白表達，Thiamet-G預處理仍然能夠抑制TNF-α誘導的炎癥因子表達。
　　(2)在轉染AD-NULL的RASMCs，Thiamet-G預處理快速提高細胞O-GlcNAc修飾水平能夠顯著抑制TNF-α誘導的RASMCs遷移;在轉染AD-shA20-2的RASMCs，Thiamet-G預處理不再能夠抑制TNF-α誘導的RASMCs遷移;而在轉染AD-A20-IRES的RASMCs，Thiamet-G預處理仍然能夠抑制TNF-α誘

6、導的RASMCs遷移。
　　(3)在轉染AD-NULL的RASMCs，Thiamet-G預處理快速提高細胞O-GlcNAc修飾水平能夠顯著抑制血清誘導的RASMCs增殖;在轉染AD-shA20-2的RASMCs，消減A20蛋白表達可廢除Thiamet-G對血清誘導RASMCs增殖的抑制;相反，過表達A20蛋白并不影響Thiamet-G對血清誘導RASMCs增殖的抑制。
　　結論：
　　快速提高細胞內O-GlcNAc修飾