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文檔簡介
1、惡性腫瘤的一個普遍特征是細(xì)胞的糖基化修飾發(fā)生了顯著的變化。腫瘤細(xì)胞表面糖蛋白糖基化形式的改變,對腫瘤細(xì)胞的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程起重要作用。目前已證實,對腫瘤細(xì)胞膜特征糖鏈結(jié)構(gòu)變化規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制的研究,具有重要的腫瘤臨床診斷和治療方面的價值。
CD147是一種廣泛表達(dá)于造血及非造血細(xì)胞系,分子量約為43-66kDa的跨膜糖蛋白,其廣泛表達(dá)以及與其他蛋白的相互作用使之能夠參與多種不同的生理病理過程,并與某些重要疾病如腫瘤、炎癥
2、等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CD147在多種腫瘤細(xì)胞、組織高表達(dá)。功能研究發(fā)現(xiàn),其通過誘導(dǎo)周圍成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs,包括MMP-1、MMP-2、MMP-9)降解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。
高度的糖基化修飾是CD147分子的重要特征之一。大量研究結(jié)果表明,各種癌組織、細(xì)胞中,CD147分子普遍高表達(dá),并伴隨高度的糖基化。CD147分子的糖基化修飾非常豐富,糖鏈約占總分子量的一半。目前的研
3、究表明,腫瘤細(xì)胞中 CD147的糖基化修飾對其誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌可能有重要意義,從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是,現(xiàn)有的關(guān)于 CD147糖基化的研究還較少且并不深入。尤其是CD147分子腫瘤相關(guān)性糖基化修飾的結(jié)構(gòu)、發(fā)揮功能的糖基化位點、CD147的糖基化修飾在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮功能的機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。研究CD147分子的N-糖基化修飾的組分及其功能,對基于靶向CD147分子的腫瘤診斷和治療具有重要意義。
本課題擬明確CD14
4、7蛋白 N-糖基化修飾的結(jié)構(gòu)特點;通過突變CD147的三個糖基化位點進(jìn)行CD147糖基化的功能研究;對CD147的腫瘤相關(guān)性糖組分β1,6 N-乙酰胺基葡萄糖分支成分進(jìn)行功能研究,闡明CD147的β1,6分支在腫瘤進(jìn)展中的意義;揭示腫瘤細(xì)胞中,EGFR信號通路參與調(diào)節(jié)CD147分子的兩種糖基化形式(HG-CD147和LG-CD147)的轉(zhuǎn)變。
第一部分:人肺癌組織中天然 CD147蛋白的純化、鑒定及糖基化結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜解析。首先我
5、們從人的肺鱗癌組織中,免疫親和層析法純化天然的CD147蛋白。對純化的蛋白進(jìn)行電泳和免疫印跡鑒定,并通過糖苷酶處理、凝集素印跡初步明確其糖基化修飾特點:根據(jù)分子量的不同,CD147主要有兩種糖基化形式(HG-CD147和LG-CD147),且均為N-糖基化修飾;CD147蛋白含有二分或三分形式的復(fù)雜型糖結(jié)構(gòu);高糖基化形式的CD147含有腫瘤相關(guān)糖糖組分:β1,6 N-乙酰胺基葡萄糖分支。蛋白樣品凍干并送至美國佐治亞大學(xué)復(fù)合糖結(jié)構(gòu)研究中心
6、進(jìn)行糖結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜解析,發(fā)現(xiàn) CD147的N-糖基化由一系列高甘露糖型和復(fù)雜糖型的寡聚糖組成,并且含有與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的糖成分:核心巖藻糖和唾液酸。
第二部分:肺癌組織中天然 CD147蛋白的寡聚狀態(tài)及其誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。通過比較肺癌組織中純化的天然 CD147真核蛋白和原核的非糖基化的CD147蛋白在溶液中的寡聚形式,我們發(fā)現(xiàn)真核的天然 CD147蛋白在溶液中完全以寡聚形式存在;而原核的非糖基化的CD147蛋白大部分
7、以單體形式存在,只有小部分可在溶液中形成寡聚體,提示糖基化修飾可能對維持 CD147分子的高級空間結(jié)構(gòu)起重要作用。進(jìn)一步用明膠酶譜法比較真核 CD147蛋白和原核蛋白誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性,發(fā)現(xiàn)真核 CD147蛋白能更有效的誘導(dǎo)MMPs的分泌。表明糖基化的真核CD147蛋白的高級空間構(gòu)象,對CD147誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性可能有重要意義。
第三部分:CD147糖基化位點突變的功能研究。通過定點突變 CD147的三個N-糖基
8、化位點(N44Q、N152Q、N186Q),我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)蛋白成熟的過程中,糖基化修飾對CD147蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正確折疊和向質(zhì)膜定位有重要意義。其中突變第二個糖基化位點(N152Q)后,顯著抑制其向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運,且N152Q-CD147滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的標(biāo)志蛋白表達(dá)增高。突變 CD147的糖基化位點能顯著抑制腫瘤細(xì)胞促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌,降解基質(zhì)的功能。
第四部分:CD147的腫瘤相關(guān)性糖組分β1,6
9、 N-乙酰胺基葡萄糖分支的功能研究。β1,6 N-乙酰胺基葡萄糖(GlcNAc)分支的寡聚糖,是UDP-乙酰氨基葡萄糖α-甘露糖β1–6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(糖基轉(zhuǎn)移酶V,GnT-V)催化形成的產(chǎn)物,大量研究結(jié)果表明,這種分支結(jié)構(gòu)是參與腫瘤轉(zhuǎn)移和惡性轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵糖結(jié)構(gòu)。通過構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染糖基轉(zhuǎn)移酶 V的肝癌細(xì)胞株,我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GnT-V能夠使質(zhì)膜上和腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中的CD147增多,從而CD147誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶的活性增強(qiáng),而
10、抑制β1,6分支形成的苦馬豆堿能夠抑制這一過程。
第五部分:EGFR信號通路對CD147糖基化的調(diào)節(jié)作用。我們發(fā)現(xiàn)表皮生長因子(EGF)和雙調(diào)蛋白(AR)作用于肝癌細(xì)胞株,短時間內(nèi)能夠促進(jìn)CD147基因和蛋白水平的表達(dá);而 EGFR信號通路的抑制劑 PD153035和ZD1839能夠抑制CD147的糖基化水平,隨著作用時間的延長,HG-CD147減少而LG-CD147增多,同時,CD147的細(xì)胞定位發(fā)生變化,EGFR信號通路的
11、抑制劑PD153035和ZD1839導(dǎo)致CD147在胞內(nèi)聚集而質(zhì)膜上的CD147減少。
綜上所述,本研究對CD147分子糖基化修飾的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定和功能研究,明確了CD147蛋白N-糖基化的結(jié)構(gòu)特點和腫瘤相關(guān)性糖組分,揭示了糖基化修飾可能參與調(diào)節(jié) CD147分子的胞內(nèi)成熟、質(zhì)膜轉(zhuǎn)運過程及其寡聚狀態(tài),并可影響 CD147誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。本研究從糖基化修飾的角度,闡明腫瘤相關(guān)抗原 CD147分子促進(jìn)腫瘤發(fā)展的機(jī)制,為基于
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