關(guān)于CD147分子上調(diào)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜中VEGF表達(dá)的研究.pdf

1、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種系統(tǒng)性自身免疫病，以炎性刺激下的滑膜細(xì)胞增殖，形成具有侵襲性的血管翳為特點(diǎn)。增殖的滑膜是絨毛狀的，伴發(fā)眾多微小血管。血管翳可以侵襲臨近的軟骨和骨質(zhì)，造成關(guān)節(jié)變形和功能喪失。血管新生（新生血管的出芽過(guò)程）發(fā)生在RA病理變化中最早期，是血管翳形成的基礎(chǔ)，而侵襲性血管翳的發(fā)生和發(fā)展以至導(dǎo)致軟骨、骨質(zhì)破壞機(jī)制一直是RA發(fā)病機(jī)制和治療研究的熱點(diǎn)。 血管新生可以將炎性細(xì)胞

2、運(yùn)送到滑膜組織，同時(shí)給血管翳提供氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。促進(jìn)血管新生的因子很多，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial cellgrowth factor，VEGF）是調(diào)節(jié)生理和病理?xiàng)l件下血管新生的關(guān)鍵因素。VEGF在很多病理狀態(tài)下的表達(dá)升高，可以刺激腫瘤的血管新生和轉(zhuǎn)移。VEGF的單克隆抗體在移植動(dòng)物模型中抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這些抗體目前正在進(jìn)行試驗(yàn)，以期進(jìn)行腫瘤的治療。VEGF在RA滑膜襯里細(xì)胞和巨噬細(xì)胞高度表達(dá)，在滑液中

3、表達(dá)量也明顯升高。有研究表明抑制VEGF表達(dá)以后，RA的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和臨床表達(dá)都得到改善。這些因素是如何調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)的，還有待于進(jìn)一步闡明。 CD147是一種在RA滑膜組織中高度表達(dá)的糖蛋白，既往明確它能刺激基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）產(chǎn)生引起關(guān)節(jié)破壞。MMPs與血管新生息息相關(guān)，可以降解血管周?chē)|(zhì)，為血管新生消除物理屏障；同時(shí)可上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)VEGF的輸送。由此推

4、測(cè)CD147可能間接對(duì)VEGF產(chǎn)生作用，為了深入探討CD147在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜中對(duì)VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，特設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1. 免疫組織化學(xué)染色分析 選擇15例RA患者滑膜，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行SP染色。所有RA病人均符合ACR1987年修訂的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)選擇4例骨關(guān)節(jié)炎（ostearthritis，0A）患者做對(duì)照。與4例OA滑膜組織CD147和VEGF表達(dá)相比，15例RA滑膜組織中均有CD147、VEGF均高表達(dá)

5、。其中，表達(dá)CD147的細(xì)胞主要為成纖維樣滑膜細(xì)胞、單核－巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；表達(dá)VEGF的細(xì)胞主要為成纖維樣滑膜細(xì)胞、微血管周?chē)衫w維樣細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明VEGF表達(dá)與CD147表達(dá)間存在正相關(guān)。為了觀察RA中的血管新生，采用CD31免疫組化染色來(lái)觀察RA滑膜組織。CD31在血管內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)，與HE染色下的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)一致。而在對(duì)照組的OA滑膜組織中，CD31陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞很少。提示血管新生在RA滑膜組織中占據(jù)重

6、要作用，抑制血管新生可能是治療RA的一個(gè)新方向。 2. 體外培養(yǎng)成纖維樣滑膜細(xì)胞 成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）來(lái)自手術(shù)切除的RA患者滑膜組織，剪碎，經(jīng)0.1％胰酶和0.1％膠原酶Ⅱ，37℃，5％CO2連續(xù)消化2h。用細(xì)胞濾網(wǎng)去除組織碎塊，收集過(guò)濾后的細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌，以含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM（含1mM谷胺酰胺，100U/ml青霉素、100U/ml鏈

7、霉素）重懸后，接種于75cm2的培養(yǎng)瓶中。24－48h后，去除未貼壁細(xì)胞，以后隔日換液，待細(xì)胞鋪滿瓶底后，0.25％胰酶消化，按1:3的比例傳代。用PBS洗滌以去除未貼壁細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中選用3－5代細(xì)胞，比1、2代細(xì)胞純化，同時(shí)比5代以后細(xì)胞具有更好的生物學(xué)功能。FLS經(jīng)流式（表型：<1％ CD14, <1％ CD68 and>98％ CD90）鑒定。 3. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)FLS細(xì)胞表面CD147表達(dá) FLS細(xì)胞表面的CD

8、147采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。選取細(xì)胞，調(diào)整濃度至2×105/ml，PBS洗滌后，加入FITC標(biāo)記的CD147抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人IgG做對(duì)照，避光20分鐘。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。數(shù)據(jù)結(jié)果使用CellQuest軟件分析。在使用抗CD147單抗(80mg/L) 或 LY294002 (20μmol/L)阻斷后，F(xiàn)LS細(xì)胞表面的CD147表達(dá)率明顯下降。FLS細(xì)胞表面CD147的表達(dá)率為(95.60±0.7)％，平均熒光強(qiáng)

9、度為183.56±13.68；使用抗CD147單抗(80mg/L)阻斷48 h后，CD147的表達(dá)率下降85.76％(P<0.01)；使用LY294002(20 μmol/L)阻斷48 h后，CD147的表達(dá)率下降39.75％(P<0.05)。 4.ELISA法檢測(cè)VEGF 選擇3－5代的FLS細(xì)胞，經(jīng)不含血清的DMEM洗滌，以 2×105/ml密度種于24孔板中，經(jīng)不含血清DMEM培養(yǎng)后24小時(shí)分別加入抗CD147單抗

10、、LY294002、PD98059、SP600125和SB203580，所有的實(shí)驗(yàn)做3復(fù)孔或4復(fù)孔。根據(jù)ELISA說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)上清中的VEGF。于96孔板中加入0.4 g/ml羊抗人VEGF100 μl/孔。4 ℃過(guò)夜，加入1％牛血清清蛋白室溫封閉1小時(shí)，最后分別加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品室溫孵育1.5小時(shí)。加入TMB/H2O2后發(fā)生顯色反應(yīng)，30分鐘后終止。使用ELISA自動(dòng)讀數(shù)儀于450nm處測(cè)量吸光度（OD）值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

11、曲線得出相應(yīng)的VEGF濃度。在使用抗CD147單抗(80mg/L)或LY294002 (20μmol/L)后，F(xiàn)LS細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF表達(dá)水平明顯下降。加入MAPK阻斷劑（PD98059、SP600125和SB203580）組對(duì)VEGF表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。加入抗CD147單抗阻斷劑及LY294002阻斷劑組VEGF水平變化如表1所示。加入抗CD147單抗的FLS上清中VEGF的表達(dá)濃度在第6、12、24、48 h，

12、分別減少了67.28％，67.68％，67.90％，67.67％(P<0.05)。加入LY294002阻斷劑的FLS上清中VEGF的表達(dá)濃度在12、24、48 h分別減少了58.17％，79.29％，92.62％(P<0.05)。 5．RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA 使用Trizol法提取FLS細(xì)胞中的mRNA，經(jīng)cDNA逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增，使用GAPDH作為內(nèi)參照，最后1.5％凝膠電泳成像分析?？笴D147單抗的抑

13、制試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用抗CD147單抗(80mg/L)處理FLS細(xì)胞后0、6、12、24、48h的VEGF cDNA的表達(dá)明顯減弱。 RA是以關(guān)節(jié)破壞為特點(diǎn)的一種慢性炎性疾病，血管翳是其滑膜侵襲和骨質(zhì)破壞中的重要機(jī)制。在RA中高度表達(dá)的VEGF可刺激血管翳形成，促進(jìn)血管新生，推進(jìn)軟骨和骨質(zhì)的侵襲。而另一種高度表達(dá)的分子EMMPRIN/CD147通過(guò)刺激MMPs分泌，也在局部侵襲和血管新生中發(fā)揮重要作用，由此推測(cè)CD147和VEGF間

14、可能有某種聯(lián)系， RA中FLS細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD147和VEGF的意義也值得研究。本研究發(fā)現(xiàn)，在RA滑膜組織中表達(dá)CD147的細(xì)胞主要為成纖維樣滑膜細(xì)胞、單核－巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，表達(dá)VEGF的細(xì)胞主要為成纖維樣滑膜細(xì)胞、微血管周?chē)衫w維樣細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞，這些都是血管翳形成，軟骨和骨質(zhì)破壞的基礎(chǔ)。使用抗CD147單抗或PI3K-Akt阻斷劑(LY294002)可以阻斷這一過(guò)程。提示CD147-VEGF可以作為RA關(guān)節(jié)破壞的一個(gè)潛在治