CypA通過CD147分子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中對單核-巨噬細(xì)胞作用的初步研究.pdf

1、目的：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕破壞為特征的全身性、炎性自身免疫性疾病，RA的病因及發(fā)病機制目前尚不完全清楚，迄今尚無根治療法。多種炎性細(xì)胞及促炎因子參與了RA 的發(fā)生發(fā)展，其中單核/巨噬細(xì)胞集分泌因子、解剖及功能各異性于一身，是其它類型細(xì)胞不能比擬的。正因為如此，巨噬細(xì)胞影響著免疫和炎癥反應(yīng)各個方面，同時在許多疾病的病原學(xué)及發(fā)病機制中，特別是在RA發(fā)病中，起著重要的作用。 細(xì)胞環(huán)親素A是存在于多種細(xì)胞內(nèi)的

2、細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，免疫抑制劑環(huán)孢素A作用的主要靶分子，具有肽脯氨酰順反式異構(gòu)酶作用參與蛋白折疊、胞質(zhì)內(nèi)蛋白運輸、免疫紊亂機制調(diào)節(jié)、促進(jìn)炎癥反應(yīng)等多種功能。研究報道提示CypA 在RA 患者滑液中顯著高于骨關(guān)節(jié)炎患者，且與滑膜中總的細(xì)胞數(shù)相關(guān)聯(lián)。 在RA 關(guān)節(jié)滑膜層內(nèi)，CypA 主要由巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)促炎因子促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的降解。這些研究結(jié)果使CypA 與RA 關(guān)鍵的發(fā)病機制研究之間更加緊密了，但是CypA 促炎作

3、用的受體、信號通路及CypA 對RA 中巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用尚未見明確報道。 CD147 分子，又稱為基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子，屬于免疫球蛋白超家族，細(xì)胞環(huán)親素A的受體之一。CD147 在胚胎發(fā)育、器官形成、骨重建、創(chuàng)傷修復(fù)等生理學(xué)及腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、纖維化等病理生理學(xué)中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本科室以往的研究結(jié)果證實了RA 的滑膜細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞膜表面CD147 表達(dá)顯著高于正常人，并通過CD147 分子間

4、相互作用促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)MMP-2、-9 的表達(dá)及活性，進(jìn)一步加深對軟骨基質(zhì)的降解、破壞。但在RA 中關(guān)于其它炎癥因子通過CD147 受體來參與RA 發(fā)生發(fā)展的研究尚未見報道。 多個文獻(xiàn)報道提示CypA 通過與作用的靶細(xì)胞膜分子CD147 結(jié)合，在CD147 轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號作用下促進(jìn)一些疾病的發(fā)生與發(fā)展，如AIDS、SARS、胰腺癌等疾病。但這一相互作用在RA 發(fā)病機制中的作用卻未見報道。因此，本實驗在RA 關(guān)節(jié)滑膜中存在大量CypA

5、 和單核/巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD147 基礎(chǔ)之上，擬觀察CypA 對單核/巨噬細(xì)胞MMP-2、-9 的表達(dá)及細(xì)胞的黏附能力的影響，并通過RNAi、抗體及拮抗劑封閉CD147 功能來證實這一作用是否需要CD147 分子的參與。 本課題研究將CypA 通過CD147 分子相互作用、CD147 分子介導(dǎo)信號通路的研究思路用于CypA 在RA 發(fā)病機制中的研究，該結(jié)果對進(jìn)一步認(rèn)識CypA、CD147 分子及兩者相互作用復(fù)合物在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)

6、炎發(fā)病機制的作用有著重要的意義，并為今后RA 發(fā)展積極有效的新治療思路提供了良好的理論基礎(chǔ)。 方法： 1. CypA 對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑液單核/巨噬細(xì)胞MMP-2、-9 表達(dá)的影響收集臨床上RA 活動期患者外周血及關(guān)節(jié)滑液，使用單核細(xì)胞陰性分選磁珠獲得單核/巨噬細(xì)胞；重組人M-CSF 刺激單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞；重組人CypA 刺激單核/巨噬細(xì)胞，明膠酶譜及侵襲小室實驗觀察細(xì)胞MMP-2、-9 的表達(dá)及細(xì)胞侵襲能力的變化

7、。CsA、AP-9 等因子阻斷CypA與CD147 相互結(jié)合的作用，分析CD147 在CypA 對激單核/巨噬細(xì)胞MMPs表達(dá)及侵襲能力生物學(xué)功能中的作用。 2. RNAi 作用CD147選擇人單核細(xì)胞系THP-1 作為體外細(xì)胞研究對象，PMA 誘導(dǎo)THP-1 分化為巨噬細(xì)胞。設(shè)計作用與CD147 分子的siRNA 干涉片段，封閉細(xì)胞表面CD147 分子的表達(dá)，流式檢測RNAi 效果。 3. CypA 對THP-1

8、細(xì)胞MMP-2、-9 表達(dá)活性及侵襲、運動能力的影響重組人CypA 刺激THP-1 細(xì)胞，收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清，實時RT-PCR、明膠酶譜實驗檢測MMP-2、-9 mRNA 及蛋白分泌水平的變化，細(xì)胞侵襲實驗分析細(xì)胞運動、侵襲能力的改變。CsA、AP-9 等因子阻斷CypA 與CD147相互結(jié)合的作用，分析CD147 在CypA 對THP-1 細(xì)胞MMPs 表達(dá)及侵襲能力生物學(xué)功能中的作用。 4. CypA、CsA 及AP-

9、9 對THP-1 細(xì)胞CD147 表達(dá)的影響觀察本課題相關(guān)的CypA、CsA 及AP-9 作用THP-1 細(xì)胞后，細(xì)胞CD147在mRNA 及蛋白水平的變化情況。 5. CypA 通過MAPK 通路對細(xì)胞NF-κB 活性的影響核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)增強THP-1 細(xì)胞MMP-9 的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平。在CypA 的刺激作用下，通過免疫熒光實驗來檢測細(xì)胞胞漿及核內(nèi)p50蛋白量的變化。同時使用CsA、AP-9 等因子阻斷C

10、ypA 與CD147 相互作用，分析CD147 是否參與了這一信號通路。CD147 分子通過MAPK 通路上調(diào)細(xì)胞的MMPs 的表達(dá)。本實驗通過使用ERK、JNK 及P38 的三個MAPK通路抑制劑來分別阻斷MAPK 通路的作用，觀察是否可以阻斷CypA 對NF-κB 激活的作用，并明確這一作用中參與調(diào)節(jié)的MAPK 通路。 6. CypA 對THP-1 細(xì)胞Ca2＋運動、細(xì)胞黏附能力的影響激光共聚焦觀察CypA 對細(xì)胞內(nèi)Ca2

11、＋運動的影響，細(xì)胞黏附實驗觀察CypA對細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附能力的影響；同時使用CsA、抗CD147 抗體HAb18等阻斷CypA 與CD147 相互結(jié)合的作用，分析CD147 是否參與CypA 對細(xì)胞Ca2＋運動、細(xì)胞黏附能力的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果： 1. CypA 對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑液單核/巨噬細(xì)胞MMP-2、-9 表達(dá)的影響M-CSF 成功誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。明膠酶譜結(jié)果顯示正常人及RA外周血單核細(xì)胞分化為成熟

12、的巨噬細(xì)胞后，MMP-9 表達(dá)顯著增強，MMP-2無顯著變化；CypA 顯著增加RA 滑液內(nèi)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、正常人及RA外周血單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞MMP-9 的表達(dá)，而對分化前的單核細(xì)胞則無顯著上調(diào)作用。CypA 對正常人及RA 外周血分化前后單核細(xì)胞的MMP-2均無調(diào)節(jié)作用。CsA 及AP-9 顯著抑制CypA 對細(xì)胞MMP-9 的上調(diào)作用。 侵襲小室結(jié)果顯示正常人及RA外周血單核細(xì)胞分化為成熟的巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞的侵襲

13、能力均顯著增強；RA 外周血分化前后單核細(xì)胞的侵襲能力均高于正常人外周血分化前后單核細(xì)胞。CypA 顯著增加正常人及RA 外周血巨噬細(xì)胞侵襲能力，而對單核細(xì)胞則無顯著作用。 2. RNAi 作用CD147qRT-PCR 及流式結(jié)果顯示siRNA 片段可以顯著抑制CD147 的表達(dá)，陰性對照siRNA 對CD147 表達(dá)無影響，選擇siRNA I 作為進(jìn)一步實驗的干涉作用。 3. CypA 對THP-1 細(xì)胞MMP-2

14、、-9 表達(dá)活性及侵襲、運動能力的影響CypA 可以顯著增加分化前及分化后THP-1 細(xì)胞MMP-9 mRNA 及蛋白表達(dá)水平；而對MMP-2 無顯著作用。CypA 增強分化前及分化后THP-1 細(xì)胞的侵襲能力。RNAi、CsA、AP-9 顯著抑制分化前及分化后THP-1 細(xì)胞MMP-2、-9 mRNA 及蛋白分泌水平和細(xì)胞侵襲能力；同時可以抑制CypA 對MMP-9的上調(diào)及細(xì)胞侵襲能力增強的作用。 4. CypA、CsA 及

15、AP-9 對細(xì)胞CD147 的影響qRT-PCR 及流式結(jié)果顯示CypA 對THP-1 細(xì)胞CD147 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平均無顯著影響；CsA 則顯著抑制下調(diào)CD147 的表達(dá)；AP-9 可有效的封閉細(xì)胞膜表面CD147 分子。 5. CypA 通過MAPK 通路對細(xì)胞NF-κB 活性的影響免疫熒光結(jié)果顯示CypA 顯著增強THP-1 細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)及核內(nèi)p50 蛋白量，CsA、AP-9 則顯著抑制CypA 對p50 的上

16、調(diào)作用。明膠酶譜實驗結(jié)果顯示ERK 及JNK MAPK 抑制劑顯著抑制THP-1 細(xì)胞MMP-9 的表達(dá)，同時可阻斷CypA 對MMP-9 的上調(diào)作用；P38 MAPK 抑制劑對THP-1 細(xì)胞MMP-9的表達(dá)則無影響，且對CypA 上調(diào)MMP-9 的作用無抑制作用。 6. CypA 對細(xì)胞Ca2＋運動、細(xì)胞黏附能力的影響激光共聚焦結(jié)果顯示CypA 顯著增強THP-1 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋的運動，CsA及HAb18可阻斷CypA

17、對游離Ca2＋運動的上調(diào)作用；HAb18顯著抑制THP-1細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋的運動。細(xì)胞黏附實驗結(jié)果顯示CypA 顯著增強THP-1 細(xì)胞與ECM 的黏附能力，而這一作用可被CsA 及HAb18 阻斷。CsA 及HAb18顯著降低THP-1 細(xì)胞與ECM 的黏附能力。 結(jié)論： 本課題研究結(jié)果顯示CypA 通過與CD47 分子直接結(jié)合、上調(diào)單核/巨噬細(xì)胞MMP-9 的表達(dá)及細(xì)胞侵襲運動能力，同時增強細(xì)胞內(nèi)Ca2＋運動及細(xì)