29924.分子突變改善擴展青霉脂肪酶的耐熱性

1、摘要摘要擴展青霉脂肪酶(PEL)可在油水界面催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油，是‘工業(yè)生產(chǎn)上一種重要的水解酶。本研究利用疊加突變技術(shù)手段，對擴展青霉脂肪酶(PenicilliumexpansumlipasePEL)進行熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)工程改造。ep8是由本課題組前期獲得的含有一個突變點的擴展青霉脂肪酶隨機突變體，其熱穩(wěn)定性比野生型有所提高。作者以ep8為模板，利用重疊延伸PCR構(gòu)建了pPIC35Kep8K56R、pPIC35Kep8一P

2、90D、pPIC35K—ep8一E207P、pPIC35K—ep8E221P、pPIC35Kep8K226A、pPIC35Kep8一P82D、pPIC35Kep8E113P、pPIC35Kep8一1164S、pPIC35Kep8一K115P、pPIC35Kep8S139R、pPIC35Kep8N157Y、pPIC35Kep8K56RKI15R等突變基因表達載體。將這些攜帶突變基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GSll5，獲得了12種含有突變基

3、因的脂肪酶基因工程菌：PELep8K56RGS、PELep8P90DGS、PELep8E207PGS、PELep8一E221PGS、PELep8一K226AGS、PELep8P82DGS、PELep8El13PGS、PELep8一1164S—GS、PELep8一Kll5PGS、PELep8S139RGS、PELep8N157YGS、PELep8K56RK115RGS。通過平板、搖瓶發(fā)酵并在甲醇的誘導(dǎo)下進行突變脂肪酶表達，突變脂肪酶的溫度

4、適宜性和熱穩(wěn)定性，結(jié)果顯示：PELep8一K56R、PEL—ep8一P90D、PEL—ep8一E207P，PELep8一E221P，PEL—ep8一K226A，PEL—ep8一P82D，PELep8Ell3P、PEL—ep8一1164S、PELep8K115P、PEL—ep8一S139R、PELep8N157Y、PELep8K56RK115R等12個疊加突變體中，(1)疊加突變體PELep8K56R的最適作用溫度為37“(2，比野生型脂

5、肪酶PEL的最適作用溫度下調(diào)了3“C，熱穩(wěn)定性(m)比野生型提高了14。C，比隨機突變體PELep8提高了O2℃。發(fā)酵酶活約為852U／ml，是一個熱穩(wěn)定性獲得一定提高的突變體。(2)疊加突變體PELep8P90D最適作用溫度比野生型PELGS降低6“C，Tm比隨機突變體PELep8低O8℃，比野生型高01℃；發(fā)酵酶活約為584U／mL。(3)疊加突變體PELep8K56RK115RGS的‰值為375“C，比野生型下降了25℃；發(fā)酵酶活

6、約為56U／mL。(4)疊加突變體PELep8E207P、PELep8E221P、PELep8K226A、AbstractAbstractPenicilliumexpansumlipase(PEL)playsanimportantroleincommercialproductionforitscatalyzehydrolysisfunctionInordertoimprovingthethermostabilityofthePEL，th

7、elipaseencodinggenewasmutatedbysitedirectedmutagenesisSeveralrecombinantvetorswhichcontaindoubleortriplemutantgeneswereconstructedbyoverlapextensionPCRusingthecDNAofarandom—mutantlipaseep8(asinglesitemutant)asthetemplate

8、andtwospecialprimerswereusedtogeneratemutationsiteTherecombinantvectorsweretransformedintoPichiapastorisGSll5byelectroporationandcorrespondingrecombinantexpressioncellsPELep8一K56RGS、PELep8K56RGS、PELep8P90D—GS、PEL—ep8一E20

9、7PGS、PEL—ep8一E221PGS、PELep8K226AGS、PELep8P82DGS、PELep8一Ell3P—GS、PELep8I164SGS、PELep8一Kll5P—GS、PELep8S139RGS、PEL—ep8N157YGS、PELep8一K56RK115RGSwerecreatedThecorrespondingmutantlipasePELep8K56R、PEL—ep8一P90D、PELep8一E207P、PEL

10、ep8E221P、PELep8K226A、PEL—ep8P82D、PEL—ep8Ell3P、PELep8一1164S、PELep8一Kll5P、PELep8S139R、PEL—ep8N157Y、PELep8K56RK115Rwereobtainedbyflaskshakingandthethermostabilityofthesemutantlipasesweremeasured(1)TheTmofPEL—ep8一K56Ris401℃，

11、14“Chigherthanthatofwildtypelipaseand02℃higherthanthatofrandommutantlipaseTheexpressionlevelofthedoublemutantlipaseis852U／mL(2)TheTmofPELep8P90Dis388“C，whichisclosetowildtypelipaseTheexpessionisabout584U／mL(3)TheTmoftrip

12、lemutantPELep8K56RK115Ris375“C，25“12lowerthanthatofwildtypelipaseTheexpressionlevelis56U／mL(4)Otherdouble—mutantsPELep8一E207P、PEL—ep8一E221P、PEL—ep8K226A、PELep8P82D、PEL—ep8一Ell3P、PEL—ep8一1164S、PELep8一Kll5P、PELep8S139R及PEL