脂肪酶CAl-B定點(diǎn)突變及其酶促立體選擇性研究.pdf

1、近年來對(duì)酶的微觀結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理有了更深入的研究，因此酶的定點(diǎn)突變改造提高催化特性成為活躍的研究領(lǐng)域之一。脂肪酶CAL-B催化酯化或水解反應(yīng)中對(duì)醇底物具有非常好的立體選擇性，是當(dāng)前學(xué)術(shù)界和工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的脂肪酶之一，CAL-B的催化中心由Ser(105)-His(224)-Asp(187)組成的三聯(lián)體、Thr(40)、Gln(106)組成的氧穴和特異性底物結(jié)合口袋構(gòu)成，其中兩個(gè)袋狀的基質(zhì)結(jié)合區(qū)分別結(jié)合酯類化合物結(jié)構(gòu)上的?；糠趾土u基

2、部分。本論文主要對(duì)CAL-B的特異性底物結(jié)合口袋熱點(diǎn)殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，并研究其突變株的催化立體選擇性調(diào)控規(guī)律，主要研究成果總結(jié)如下:
　　論文將CAL-B活性中心醇口袋底部104位色氨酸突變?yōu)轶w積較小氨基酸;共獲取CAL-B的突變株WB系列29種。其中WB2-WB8為單一位點(diǎn)突變株，WB9-WB12在WB7基礎(chǔ)上將活性口袋入口處281位、282位氨基酸突變;WB14在WB9基礎(chǔ)上將酸口袋中149位氨基酸突變;WB22在WB9的基礎(chǔ)

3、上再突變了144位的氨基酸;WB15-WB25（除WB22）在WB9基礎(chǔ)上對(duì)酸口袋144位、149位氨基酸進(jìn)行了一系列突變;經(jīng)過基因測序檢驗(yàn)基因序列并確認(rèn)正確。實(shí)驗(yàn)主要純化了5種突變株的酶液，通過SDS-PAGE凝膠電泳測定雜蛋白的含量明顯減少，CAL-B及其突變株的分子量約33kDa;實(shí)驗(yàn)得到純酶溶液，并直接在酶液中加入表面活性劑冷凍干燥獲得固體酶粉。
　　論文研究了CAL-B突變株催化乙酸蘇合香酯水解合成手性仲醇的立體選擇性，

4、并用手性氣相色譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究表明:野生型CAL-B催化乙酸蘇合香酯水解選擇R構(gòu)型的底物水解，而CAL-B突變株優(yōu)先選擇S構(gòu)型的底物水解，立體選擇性發(fā)生了反轉(zhuǎn)，其中WB2、WB7、WB11、WB14、WB15、WB16、WB17、WB18、WB20、WB21等10種突變株的催化活性和立體選擇性最優(yōu)，一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)率達(dá)30％至50％左右，ee值在78％以上，E值均大于20。論文進(jìn)一步研究CAL-B突變株催化選擇性與底物結(jié)構(gòu)的關(guān)系，當(dāng)

5、底物手性碳原子上烷基鏈逐漸增長到5個(gè)碳原子時(shí)，突變株的催化效率逐漸提高而選擇性逐漸下降，但野生型CAL-B催化活性快速減低;當(dāng)苯基依次被溴、硝基、甲氧基取代后，突變株的催化活性迅速降低;活性口袋對(duì)催化效率和立體選擇性均有明顯影響。CAL-B突變株催化的底物適應(yīng)性結(jié)果表明:CAL-B突變株有較廣的底物范圍，可催化一系列底物拆分合成手性仲醇。論文還研究了CAL-B突變株104位被突變回色氨酸后新酶WB26、WB27催化乙酸蘇合香酯立體選擇性

6、與野生型一致，進(jìn)一步證明了104位突變是選擇性反轉(zhuǎn)的重要因素。
　　論文研究了CAL-B突變株催化1-苯乙醇與醋酸乙烯酯酰化拆分反應(yīng)的立體選擇性，主要考察了突變株WB2、WB7、WB11、WB14在甲苯中催化選擇性酯化的反應(yīng)活性與立體選擇性。結(jié)果表明:CADB突變株催化選擇性酯化中，主要選擇S構(gòu)型底物醇反應(yīng)，4種突變株均表現(xiàn)出相同的立體選擇性，且WB7和WB11催化性能最佳;CAL-B野生型則主要選擇R構(gòu)型底物醇反應(yīng);這與水解拆分