基于鄰近表面雜交分析的電化學生物傳感技術用于蛋白和核酸的檢測.pdf

1、隨著人類基因組計劃的完成和功能蛋白質組學、基因組學的研究進展，發(fā)展高靈敏的方法用于蛋白質和核酸的快速分子監(jiān)測就成為后基因時代的主要研究領域。電化學傳感器由于其儀器簡單、靈敏、選擇性高等優(yōu)點吸引了許多研究人員的注意，并成為研究的熱點。 基于當前對蛋白質和核酸的檢測技術提出的高靈敏、高選擇、高特異性和簡便、高通量的要求，本論文發(fā)展了一系列新的電化學生物傳感方法用于檢測蛋白質和核酸，為蛋白質和核酸分子檢測提供高性能的技術平臺。并通過對

2、實際樣品的分析以及與經(jīng)典檢測方法的結果對照，初步驗證了這些技術的實用性。 (1)在第2章，我們利用核酸適體這一種通過體外組合化學篩選技術所得到的對目標蛋白分子具有高親和力的寡核苷酸探針，基于一對親合性核酸適體探針同時識別目標分子而空間鄰近導致與某一互補序列雜交使穩(wěn)定性提高這一鄰近效應，提出了一種高靈敏的檢測模型分析物血小板衍生生長因子BB(PDGF—BB)的表面鄰近雜交分析電化學適體傳感方法。該法首先在金電極表面利用巰基自組裝技

3、術固定了巰基修飾的短鏈寡核苷酸探針，設計了一個尾端延伸序列與短鏈寡核苷酸探針互補的PDGF—B核酸適體探針。該適體探針尾端修飾電活性基團二茂鐵，且單個尾端序列與表面固定的短鏈寡核苷酸探針的熔鏈溫度較低。利用該核酸適體探針可成對地與二聚體目標蛋白PDGF—BB同時結合，由于鄰近效應促進兩尾端序列同時與電極表面固定的兩條短鏈寡核苷酸雜交，使得適體探針末端二茂鐵標記與電極充分接近而發(fā)生高效電子傳遞，產(chǎn)生了顯著的氧化還原電流。我們運用循環(huán)伏安法

4、、差示脈沖伏安法、阻抗譜對該法進行了系統(tǒng)的表征，證實了該傳感機理。結果表明，該法可實現(xiàn)PDGF—BB的高特異性地檢測，響應動態(tài)范圍可從1.0 pg/mL到20 ng/mL，檢測限可達1.0 pg/mL。 (2)鑒于上述鄰近表面雜交分析技術中涉及一對鄰近探針同時與第三探針的雜交，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)這種鄰近雜交對熱穩(wěn)定性的改善仍然不是充分大，不利于分析靈敏度的提高與探針的設計。第3章中，我們在此實驗發(fā)現(xiàn)的基礎上，基于一對不同的核酸適體

5、探針與目標蛋白同時結合而彼此鄰近的效應，進一步發(fā)展了相關模型蛋白PDGF—BB檢測的電化學適體表面鄰近雜交分析傳感技術。該法首先在金電極表面利用巰基自組裝技術固定了巰基修飾的短鏈寡核苷酸探針，設計了一個尾端延伸序列與短鏈寡核苷酸探針5’半片段互補的PDGF—B核酸適體探針，該適體探針尾端修飾電活性基團二茂鐵，且單個尾端序列與表面固定的短鏈寡核苷酸探針的熔鏈溫度較低。同樣地，設計了另一個尾端延伸序列與短鏈寡核苷酸探針3’半片段互補且熔鏈溫

6、度較低的PDGF-B核酸適體探針，其識別位點與第一適體探針不同，并且尾端序列下游具有與第一核酸適體探針尾端上游有較短的互補序列，這一短互補序列熔鏈溫度也較低。兩條不同的核酸適體探針可同時識別PDGF不同位點由于鄰近而相互雜交，雜交體兩尾端序列可與電極表面固定的巰基短鏈寡核苷酸雜交，并使末端二茂鐵標記與電極充分接近，產(chǎn)生了顯著的氧化還原電流。結果表明，該方法檢測范圍更寬，從0.1 pg/mL到50 ng/mL，檢測限降低了一個數(shù)量級，為0

7、.1 pg/mL。 (3)第4章中，鑒于表面鄰近雜交分析的高特異性與高靈敏度，我們發(fā)展了目標核酸分子檢測的表面鄰近雜交電化學傳感技術，進一步拓展了表面鄰近雜交分析的應用范圍。與蛋白分子表面鄰近雜交不同的是，核酸分子鄰近雜交可利用待測核酸序列本身構成一對鄰近探針。為此，我們設計了一個寡核苷酸檢測探針，其3’末端修飾二茂鐵，5’半片段與目標核酸分子互補且具有較高熔鏈溫度，若目標核酸分子存在，檢測探針與其雜交形成穩(wěn)定的雜交體，雜交體一

8、側檢測探針與目標核酸分子其余序列鄰近，促進與電極表面固定的巰基短鏈寡核苷酸雜交，并使末端二茂鐵標記與電極充分接近，產(chǎn)生了顯著的氧化還原電流。與傳統(tǒng)夾心式雜交分析相比，該法保證了末端二茂鐵標記與電極充分接近，電子轉移效率提高，可望顯著改善靈敏度。且由于鄰近分析使用了更短的互補序列，可有效提高其選擇性。結果表明，該方法檢測的線性范圍寬，為1 fM到1 nM，而且能夠成功的識別不同堿基數(shù)錯配的序列。 (4)第5章中，鑒于目前核酸適體較

9、為有限不能滿足大量蛋白檢測的需要，我們發(fā)展了目標蛋白分子檢測的表面鄰近雜交電化學免疫傳感技術，用一對核酸探針修飾的抗體代替核酸適體探針，將表面鄰近雜交分析拓展運用于蛋白質的免疫檢測，為建立蛋白分子檢測的通用技術平臺提供技術依據(jù)。以前列腺特異性抗原PSA為模型分析物，提出了基于表面鄰近雜交分析的高靈敏PSA的電化學免疫傳感技術。此技術原理與第3章的電化學適體傳感器類似，利用一對識別PSA不同抗原決定簇的單克隆抗體，設計了與這一對單克隆抗體

10、共價交聯(lián)的兩個寡核苷酸探針，一個尾端延伸序列與巰基修飾短鏈寡核苷酸探針5’半片段互補且熔鏈溫度較低，該探針3’端修飾二茂鐵；另一個尾端延伸序列與巰基修飾短鏈寡核苷酸探針3’半片段互補且熔鏈溫度較低，而且，第二探針尾端序列下游與與第一探針尾端上游有較短的互補序列，這一短互補序列熔鏈溫度也較低?？贵w對與抗原同時結合后，兩核酸探針由于鄰近而相互雜交，雜交體兩尾端序列可與電極表面固定的巰基短鏈寡核苷酸雜交，并使末端二茂鐵標記與電極充分接近，產(chǎn)生

11、了顯著的氧化還原電流。結果表明，該方法檢測動態(tài)范圍為25 pg到1 ng，檢測下限為25 pg，且該免疫傳感器可再生使用。 (5)第6章中，提出了一種基于分子信標變構控制的電化學通道法檢測目標核酸分子雜交反應的電化學DNA傳感方法。該方法設計運用了一種發(fā)夾結構核酸探針分子，其一端標記有生物素作為阻塞源，另一端標記氨基并通過二硫雜環(huán)化合物共價固定于金電極表面，電極用巰基十一酸自組裝膜封閉。由于發(fā)夾探針莖部核酸雙鏈螺旋體空間位阻較大

12、，生物素阻塞元與巰基十一酸疏水烷基鏈作用進一步提高空間位阻，不利于電活性分子表面擴散。當探針與目標核酸分子雜交時，探針發(fā)夾構象改變，莖部雙鏈結構改變?yōu)槿嵝詥捂溄Y構，阻塞物離開電極表面，在巰基十一酸自組裝膜內形成電化學針孔通道，使得電活性分子可進行表面擴散，產(chǎn)生電化學氧化還原電流。使用該方法對包含第142位密碼子的α地中海貧血基因片斷進行了分析。濃度檢測動態(tài)線性范圍為2.8×10-18-8.7×10-8M，檢測限可達10-18M。該方法靈

13、敏、特異性好、無需標記、可再生，可以很好地用于單堿基錯配的區(qū)分。 (6)第7章中，建立了一種基于納米金標記及金增強表面吸附伏安分析的新型電化學免疫傳感技術。該方法以人免疫球蛋白G(hIgG)為模型分析物，將羊抗人免疫球蛋白G抗體固定于玻碳電極表面構成免疫傳感器界面。固定化抗體與分析目標物hIgG發(fā)生免疫反應而將hIgG捕獲，利用夾心法將納米金標記的hIgG抗體結合于電極表面。通過納米金自催化還原可在電極表面形成大粒徑納米金顆粒，