核酸分子雜交及pcr技術

1、1核酸的分子雜交技術核酸的分子雜交技術一、核酸分子雜交一、核酸分子雜交用標記的已知DNA或RNA片段（探針）來檢測樣品中未知核酸序列，通過核苷酸間堿基互補的原則發(fā)生異源性結合，再經顯影或顯色的方法，將結合核酸序列的位置或大小顯示出來。待測的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因組DNA和組織細胞的RNA。二、核酸分子雜交的分類二、核酸分子雜交的分類液相雜交核算分子雜交印記雜交固相雜交原位雜交1.固相雜交：固相雜交：將需要

2、雜交的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，另一條核酸鏈游離在液體中。2.液相雜交：液相雜交：參與反應的兩條核酸鏈都游離在液體中。常用固相雜交類型：Southern印跡雜交、Nthern印跡雜、菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、組織原位雜交、夾心雜交等。三、核酸分子雜交的基本原理三、核酸分子雜交的基本原理1、變性：、變性：在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙鏈螺旋或發(fā)夾結構被拆開，有規(guī)則的空間結構被破壞，形

3、成單鏈分子，稱為核酸的變性。﹡引起核酸變性的因素因素：熱、酸、堿、化學試劑（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。﹡加熱變性是最常用的方法常用的方法，一般加熱80100℃數(shù)分鐘即可使核酸分子氫鍵斷裂，雙鏈分開。﹡變性的核酸分子失去了生物活性，同時理化性質也隨之改變，其紫外吸收值（A260）也隨之升高?？捎米贤馕盏淖兓瘉砀橠NA的變性過程。以A260吸收值對應溫度作圖，得到DNA的變性曲線或熔解曲線。增色效應：增色效應：DNA變性后對260nm

4、紫外光收增加的現(xiàn)象。DNA熱變性現(xiàn)象熱變性現(xiàn)象雙螺旋結構即發(fā)生解體，兩條鏈分開形成無規(guī)則線團。同時，一系列物化性質發(fā)生改變：260nm處紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。由于二級結構的喪失，也失去34、預雜交、預雜交為了減少探針與廣泛存在的非互補核酸的非特異性結合，在雜交前可用封閉物將這些非特異位點封閉。在雜前的這些處理過程稱為預雜交預雜交。﹡常用于預雜交的封閉物：常用于預雜交的封閉物：﹡變性的非特異性變性的非特異性DNA：常用

5、鮭魚精子鮭魚精子DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA。當與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個背景覆蓋一層。由于它們與探針無同源性，在雜交反應中可大大減少探針的非特異性結合非特異性結合，使背影清晰。﹡高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白小牛血清白蛋白、聚蔗糖。四、核酸探針四、核酸探針1、定義：、定義：一段帶

6、有檢測標記檢測標記的與目的基因或目的DNA特異互補的已知核苷酸序列。為確定探針是否與相應基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結合部位獲得可識別的信號。﹡分子雜交技術的應用分子雜交技術的應用利用核酸探針，可以：?通過同源性比較研究不同物種或個體DNA之間的親緣關系；?通過雜交的嚴緊性發(fā)現(xiàn)基因的缺失或突變；?通過標記信號的強度測定某種遺傳信息量的多少；?證明某種疾病(如腫瘤)是否與某種基因(如病毒基因)有關。2、探針的制備方法、探

7、針的制備方法探針長度一般以50300bp為宜。制備方法：1）利用DNA重組技術2）PCR擴增3）化學合成3、探針的分類：、探針的分類：據(jù)制備方法及核酸性質不同，可分為：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針（1）寡核苷酸探針：）寡核苷酸探針：由實驗者設計、經核苷酸合成儀合成。目前的合成儀均可合成70100bp長的寡核苷酸，但一般常用的寡核苷酸針長1830bp。優(yōu)點：優(yōu)點：①制備方便，實驗者可根據(jù)需要自行設計，避免了天然

8、核酸探針存在的高度重復序列。②由于大多數(shù)寡核苷酸探針長度只有1530bp，其中即使有一個堿基不配對一個堿基不配對也會顯著影響其熔解溫度。因此它特別適用于基因點突變分析。③比活度高，適用于大多數(shù)雜交，如DNA序列測定、Sounthern、Nthern原位雜交等。缺點：缺點：探針短，與靶序列形成的雜交體穩(wěn)定性差，對雜交及漂洗的溫度、鹽濃度等條件要求高，操作難度大；探針特異性差，背景噪音也大。（2）基因組）基因組DNA探針：探針：利用機械剪切