pcr分子診斷技術(shù)

1、PCR分子診斷技術(shù),王洋 2016.12.27,,內(nèi)容,PCR技術(shù)的概念及發(fā)展簡(jiǎn)史PCR反應(yīng)的基本成分PCR基本原理和反應(yīng)過(guò)程實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基本原理和方法PCR技術(shù)的應(yīng)用、臨床意義及發(fā)展趨向臨床PCR檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室管理,PCR技術(shù)的概念及發(fā)展簡(jiǎn)史,PCR概念 PCR的由

2、來(lái)是Polymerase chain reaction的首個(gè)字母的組合，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡(jiǎn)稱，是一項(xiàng)體外擴(kuò)增DNA序列的技術(shù)。PCR發(fā)展簡(jiǎn)史 ?1985年美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，從此PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的認(rèn)同，并與1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

3、 1,,?1988年saiki 從水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱DNA聚合酶，此酶能耐高溫，在熱變性中不會(huì)失活，從而解決了PCR操作技術(shù)中酶鈍化為實(shí)際操作而帶來(lái)的困擾，極好的提高了PCR的擴(kuò)增效率，從此，此酶被命名為 Taq DNA聚合酶。 ?自PCR方法不斷改進(jìn)后，現(xiàn)PCR方法已衍生幾十種之多，目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法已被臨床廣泛應(yīng)用，不僅可以用于定

4、性檢測(cè)而且可以確定原始樣品含量。廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、微生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)研究中，由于PCR方法有著極強(qiáng)的實(shí)用性，因此仍會(huì)被不斷完善，進(jìn)一步在生命科學(xué)研究中發(fā)揮更好的作用。,PCR反應(yīng)的基本成分,?模板 是待擴(kuò)增序列的核酸，包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、mRNA和細(xì)胞等都可以作為PCR反應(yīng)的模板。?特異性引物 是

5、與靶DNA 3’和 5’端特異性結(jié)合的寡核苷酸片段，是決定PCR特異性的關(guān)鍵。當(dāng)每條引物都能特異性地與模板DNA中的靶序列復(fù)性形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，才能保證其特異性。?熱穩(wěn)定DNA聚合酶 是PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的關(guān)鍵，是從嗜熱古細(xì)菌中最早分離出的，最常用的DNA聚合酶。 2,?脫氧核甘三磷酸（dNTP） 標(biāo)準(zhǔn)PCR反

6、應(yīng)體系中包含4種等物質(zhì)的量濃度的脫氧核甘三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。?二價(jià)陽(yáng)離子 所有的熱穩(wěn)定DNA聚合酶都要求有游離的二價(jià)陽(yáng)離子，常用的是Mg2＋，Mn2+ ?緩沖液 維持PCR反應(yīng)體系中的PH，使用Tris－Cl緩沖液。?一價(jià)陽(yáng)離子 標(biāo)準(zhǔn)的PCR緩沖液中包含50mmol／L的KCl，有益于DNA片段的擴(kuò)增。,PCR的基本反應(yīng)原理和特點(diǎn),PCR原理

7、 PCR基本過(guò)程類似于DNA的天然復(fù)制，特異性依賴于靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。整個(gè)過(guò)程由變性－退火－延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。 變性：模版DNA經(jīng)加熱至94℃左右，雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙股螺旋解鏈，變成兩條單鏈，為與引物結(jié)合做準(zhǔn)備。 退火：DNA加熱變性成單鏈后，當(dāng)溫度降至一定程

8、度（55℃左右）時(shí)，引物即與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。 延伸：在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP為原料，按A－T、C－G堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原則，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的鏈。 3,重復(fù)上述變性－退火－延伸

9、的循環(huán)過(guò)程，每一循環(huán)獲得的“半保留半復(fù)制”鏈繼續(xù)成為下次循環(huán)的模板。通常一個(gè)完整的循環(huán)時(shí)間需要2-4min，2-3h就能將靶核酸放大幾百萬(wàn)倍。 一般臨床擴(kuò)增目的核酸將循環(huán)次數(shù)設(shè)定在40-50個(gè)循環(huán)之間，以此達(dá)到擴(kuò)增目的。,PCR的特點(diǎn)?特異性高 包括：引物的特異性及延伸時(shí)，堿基配對(duì)的正確性；Taq DNA聚合酶的穩(wěn)定性。?靈敏度高 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)方式增長(zhǎng)，能在2-3h內(nèi)，將1個(gè)靶分子DNA擴(kuò)增至10億個(gè)

10、分子，因此一個(gè)反應(yīng)體系中如有2-3個(gè)靶分子，則可成功檢測(cè)出目的基因。?簡(jiǎn)便快速 通過(guò)PCR技術(shù)可在2-4小時(shí)之內(nèi)獲得目的基因，為臨床患者提供快速準(zhǔn)確的確診檢測(cè)。,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法,概念 指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序以及信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)及時(shí)分析目的基因的拷貝數(shù)目，通過(guò)與已知量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量的方法。反應(yīng)過(guò)程 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)過(guò)程中，對(duì)整個(gè)過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)

11、的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式“S”增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終不再以指數(shù)方式生產(chǎn)模板，而進(jìn)入“平臺(tái)期”。 4,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法熒光閾值和循環(huán)閾值,熒光閾值（threshold） 概念：是在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)

12、度標(biāo)準(zhǔn)，即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)。,,循環(huán)閾值（cycle threshold value，Ct） 概念：PCR擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。特點(diǎn) 操作簡(jiǎn)便、快速、高效、較高的靈敏性及特異性、污染性低。,PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用、意義及發(fā)展趨向,PCR臨床應(yīng)用?感染性疾病的診斷與治療 包括：病毒：肝炎病毒、HIV、HPV、流感病毒等 細(xì)菌

13、：結(jié)核桿菌、TP、UU、CT、NG等 寄生蟲：弓形蟲、瘧原蟲等?遺傳性疾病的診斷及預(yù)防 包括：染色體疾病、血紅蛋白病、血友病、遺傳性耳聾、糖尿病等 ?腫瘤標(biāo)志物的監(jiān)測(cè)與診斷 包括：乳腺癌、腸癌、白血病等 ?個(gè)體化用藥的臨床指導(dǎo) 包括：藥物作用靶點(diǎn)相關(guān)基因、藥物代謝酶基因、藥物副作用相關(guān)基因等,PCR臨床意義：? 快速確診是否有病毒、細(xì)菌等致病性微生物感染；?了解體內(nèi)感染的數(shù)量、復(fù)

14、制程度，是否具有傳染性；?對(duì)臨床治療的用藥監(jiān)測(cè)，有無(wú)好轉(zhuǎn)或耐藥情況，如產(chǎn)生耐藥，如何指導(dǎo)用藥種類及計(jì)量等。PCR的發(fā)展趨勢(shì) 隨著臨床分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，DNA測(cè)序技術(shù)已逐漸成熟，可為臨床疾病的分子診斷提供更精確的判定依據(jù)，現(xiàn)由一代測(cè)序技術(shù)已發(fā)展至三代測(cè)序技術(shù)，為醫(yī)療領(lǐng)域帶來(lái)更方便、快捷的檢測(cè)手段。,臨床PCR檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室管理,PCR實(shí)驗(yàn)室的布局設(shè)計(jì)臨床PCR檢驗(yàn)標(biāo)本的采集、運(yùn)送PCR核酸檢測(cè)的工作流程PCR污染的

15、產(chǎn)生及預(yù)防措施實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀簡(jiǎn)介臨床PCR檢驗(yàn)的質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的建立,PCR實(shí)驗(yàn)室的布局設(shè)計(jì),原則：各區(qū)獨(dú)立、注意風(fēng)向、因地制宜、方便工作。區(qū)域劃分：試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。注意事項(xiàng)：1.每個(gè)區(qū)域應(yīng)分開獨(dú)立，各區(qū)域設(shè)計(jì)緩沖間。不能將各區(qū)域的設(shè)施物品交叉使用，不易使用中央空調(diào)、注意傳遞窗的設(shè)置避免發(fā)生區(qū)域間空氣直通的現(xiàn)象。2.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣在PCR實(shí)驗(yàn)室專用走廊內(nèi)應(yīng)按照試劑準(zhǔn)備區(qū)－標(biāo)本制備

16、區(qū)－擴(kuò)增區(qū)－產(chǎn)物分析區(qū)單一方向流動(dòng)，避免空氣反向流動(dòng)，將PCR后區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物帶入前區(qū)的潔凈區(qū)域。3.各區(qū)域應(yīng)配置專用的工作用品、紫外燈及儀器設(shè)備等物品。,臨床PCR檢驗(yàn)標(biāo)本的采集、運(yùn)送,標(biāo)本采集?采集時(shí)間（選擇最具有臨床感染特點(diǎn)的時(shí)間點(diǎn)，防止臨床出現(xiàn)假陰性結(jié)果）?標(biāo)本類型和采集量（針對(duì)不同病原體的特性，選擇正確的標(biāo)本類型及采集量）?采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)（指標(biāo)本的質(zhì)量是否符合檢測(cè)要求，如血液標(biāo)本有無(wú)溶血、脂血，分泌物標(biāo)本有無(wú)采集到足夠的

17、脫落細(xì)胞等）?采樣容器的選擇（一般應(yīng)選擇無(wú)菌密封的容器，血液標(biāo)本需選擇含EDTA、枸櫞酸鹽抗凝劑的容器，防止肝素納抑制核酸物質(zhì)的提?。?標(biāo)本運(yùn)送及保存核酸為DNA的標(biāo)本在室溫下建議8h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，2-8可保存3d；RNA的標(biāo)本4h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，如不能及時(shí)檢測(cè)應(yīng)立即分離血清－20℃存放（1-2周）。分泌物室溫下8h內(nèi)送檢，如不能及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)使用生理鹽水洗滌處理后保留沉淀于－80℃保存。檢測(cè)完畢的陽(yáng)性標(biāo)本應(yīng)分離血清至－80℃冰

18、箱存放。,PCR核酸檢測(cè)的工作流程,試劑準(zhǔn)備區(qū) 該區(qū)域?yàn)镻CR室最潔凈區(qū)域，僅存放PCR備用試劑，在配制試劑前應(yīng)從冰箱提前半小時(shí)取出，室溫解凍后使用。試劑應(yīng)根據(jù)當(dāng)日工作量酌情拿取或配制，避免反復(fù)凍融。配制及分裝過(guò)程中應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成，避免來(lái)回走動(dòng)，手套應(yīng)注意潔凈避免污染試劑。標(biāo)本制備區(qū) 將待檢測(cè)離心后的標(biāo)本放入生物安全柜或全自動(dòng)核酸提取儀內(nèi)進(jìn)行核酸的提取，標(biāo)本制備期間應(yīng)及時(shí)更換可能被污染的手套，避免交叉污染

19、。,擴(kuò)增區(qū) 將提取好的核酸擴(kuò)增反應(yīng)物加蓋密封好后放置于相應(yīng)的核酸擴(kuò)增儀中，設(shè)置好該批實(shí)驗(yàn)的模板后進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。在擴(kuò)增結(jié)束后，運(yùn)用儀器軟件分析出擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度值。產(chǎn)物分析區(qū) 此區(qū)域一般用于基因突變、分型檢測(cè)的反向點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)中，將核酸擴(kuò)增產(chǎn)物加入已固定多種探針的硝酸纖維素膜或尼龍膜中，將樣本中與膜條上同源序列的探針結(jié)合，再經(jīng)顯色后得到基因序列。 以上兩個(gè)區(qū)域是PCR實(shí)驗(yàn)室污染較為嚴(yán)重的區(qū)域，因此應(yīng)

20、每次在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)對(duì)儀器、操作臺(tái)等物品進(jìn)行紫外燈照射及消毒液（10％的次氯酸鈉、75%的酒精）擦拭，以助于擴(kuò)增產(chǎn)物的降解。,PCR污染的產(chǎn)生及預(yù)防措施,污染的來(lái)源：?標(biāo)本間的交叉污染（標(biāo)本收集時(shí)、容器密封不嚴(yán)溢灑、加樣時(shí)污染加樣器、標(biāo)本中病毒可隨氣溶膠擴(kuò)散等）?PCR試劑的污染（耗材、加樣器等）?擴(kuò)增產(chǎn)物的污染（最常見的污染源）?氣溶膠的污染（最可能、嚴(yán)重的污染源）氣溶膠：由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散

21、體系，體積為1-100nm。是由空氣與液體表面摩擦形成，實(shí)驗(yàn)操作中的劇烈震蕩反應(yīng)管，污染加樣器的反復(fù)吸樣以及在室內(nèi)來(lái)回的走動(dòng)等行為。據(jù)計(jì)算統(tǒng)計(jì)一個(gè)氣溶膠顆粒可含4.8×104個(gè)拷貝數(shù)。,污染的監(jiān)測(cè)與預(yù)防措施?加樣器：對(duì)污染的加樣器進(jìn)行及時(shí)處理，并使用一次性含有濾芯的吸頭，同時(shí)對(duì)吸頭及反應(yīng)管進(jìn)行高壓滅菌后再行使用。?試劑的配制存放：嚴(yán)防試劑配制過(guò)程中產(chǎn)生的污染、配制好的試劑必須與標(biāo)本、擴(kuò)增產(chǎn)物分開存放。?操作手法：嚴(yán)格按照

22、PCR實(shí)驗(yàn)操作要求及預(yù)防污染的原則進(jìn)行核酸提取。?設(shè)立空白及陰、陽(yáng)性對(duì)照：每批試驗(yàn)。,實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀簡(jiǎn)介,美國(guó)ABI公司在1996年推出實(shí)時(shí)熒光7700系列，于1997引入國(guó)內(nèi)，成為我國(guó)第一臺(tái)使用的擴(kuò)增儀，隨后又研發(fā)出一系列的擴(kuò)增儀，如5700、7000、7300、7500、7900等型號(hào)。1.儀器組成：ABI 7300擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（半導(dǎo)體PCR儀，鹵鎢燈光源、四色濾鏡輪和冷CCD照相機(jī)進(jìn)行熒光檢測(cè)）及配套應(yīng)用分析軟件、電腦。

23、2.檢測(cè)原理：采用精確的化學(xué)原理和復(fù)雜的多組分計(jì)算方法，準(zhǔn)確地檢測(cè)和處理PCR指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的數(shù)據(jù)，得出高精度的Ct值。,3.特點(diǎn)：多色熒光檢測(cè)（FAM、SYBR Green I、VIC／JOE、TAMRA和ROX多種熒光染料）；實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)監(jiān)控，并有熔點(diǎn)曲線實(shí)時(shí)分析；96個(gè)樣品孔采用鹵鎢燈作為光源，穩(wěn)定但壽命短。4.儀器使用的注意事項(xiàng)：放置水平、有穩(wěn)定的電壓并連接地線（配備UPS不間斷電源）、保證正常運(yùn)行的室溫溫度不超過(guò)15-25，儀器要

24、放置在通風(fēng)、散熱較好的區(qū)域，遠(yuǎn)離水源、火源、有腐蝕性物質(zhì)及磁場(chǎng)感染等環(huán)境影響。,5.儀器的維護(hù)與保養(yǎng)：在日常實(shí)驗(yàn)結(jié)束，儀器冷卻后對(duì)儀器表面進(jìn)行正常維護(hù)及保養(yǎng)工作；使用中應(yīng)小心熱蓋與反應(yīng)槽的污染，并定期使用95%的乙醇進(jìn)行擦拭，如被污染嚴(yán)重應(yīng)先使用中性消毒液進(jìn)行處理；每年應(yīng)要求儀器廠家對(duì)儀器的光學(xué)部分、溫控部分、ROI及背景進(jìn)行熒光強(qiáng)度的校正。,臨床PCR檢驗(yàn)的質(zhì)量保證,檢驗(yàn)的質(zhì)量控制是整個(gè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系運(yùn)行的核心工作，只有對(duì)檢驗(yàn)的每一個(gè)

25、環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格把關(guān)，才能保證檢驗(yàn)質(zhì)量準(zhǔn)確有效。臨床PCR檢驗(yàn)的質(zhì)量保證重點(diǎn)包括：試劑（標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品等）及消耗品的質(zhì)檢；人員資質(zhì)的要求；儀器的校準(zhǔn)及維護(hù)保養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性；實(shí)驗(yàn)室日常工作的規(guī)章制度（實(shí)驗(yàn)室及人員的生物安全和保護(hù)措施、清潔消毒）；質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)。,PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的建立,依據(jù)國(guó)內(nèi)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》和ISO15189認(rèn)可：CNAS CL02《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可》的準(zhǔn)則和美國(guó)CAP認(rèn)證的

26、PCR分子實(shí)驗(yàn)室要求等相關(guān)規(guī)定，建立標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范化的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系內(nèi)容。體系結(jié)構(gòu)?質(zhì)量手冊(cè)：闡明實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量方針、并描述質(zhì)量體系的文件，包括實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量方針、目標(biāo)、組織結(jié)構(gòu)及質(zhì)量體系要求等。?程序文件：對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作流程的文件化描述，包括目的、范圍、職責(zé)及具體工作流程等。,?作業(yè)指導(dǎo)書：實(shí)驗(yàn)室日常工作的指導(dǎo)性文件，一般分為管理、儀器、項(xiàng)目三大類，內(nèi)容包括檢驗(yàn)?zāi)康摹⒃?、?biāo)本類型、操作步驟、參考區(qū)間、臨床可報(bào)告范圍及參考文獻(xiàn)等。?