雙重PCR診斷棘阿米巴角膜炎研究.pdf

1、目的：棘阿米巴角膜炎(AK)是一種致盲率極高的慢性進(jìn)行性角膜炎。由于發(fā)病早期常缺乏特異性臨床表現(xiàn)、診斷方法欠敏感、特異性低，故常導(dǎo)致誤診、漏診、誤治。本研究采用分子生物技術(shù)雙重PCR(multiplexPCR)，同時(shí)擴(kuò)增棘阿米巴18srDNA和26srDNA基因片段，旨在探索一種快捷，方便，特異性、敏感性均高的早期診斷棘阿米巴角膜炎的方法。 方法： 1.棘阿米巴的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)研究：對(duì)延邊醫(yī)學(xué)院提供的三種己知基因序列的棘阿

2、米巴(Acanthamoebasp.CJY/s基因型、CJY/s2基因型和Neff基因型)用PYG培養(yǎng)液培養(yǎng)、保種，并用革蘭氏染色進(jìn)行滋養(yǎng)體和包囊的形態(tài)學(xué)觀察。 2.PCR及雙重PCR擴(kuò)增棘阿米巴18SrDNA和(或)26SrDNA基因方法學(xué)的建立。 3.棘阿米巴的動(dòng)物(兔子)模型建立及雙重PCR應(yīng)用：用CYL/S2基因型棘阿米巴PYG懸濁液注射兔子左眼角膜基質(zhì)層，使兔子感染棘阿米巴引起角膜炎；右眼做為對(duì)照，建立棘阿米巴

3、角膜炎動(dòng)物模型。觀察兔子左、右眼變化。用雙重PCR檢測兔子兩眼分泌物、眼沖洗液、眼角膜刮片及眼角膜活檢組織。兔子兩眼角膜病理切片并HE染色觀察棘阿米巴滋養(yǎng)體及包囊的形態(tài)。 4.雙重PCR法和無營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)法檢測：83例在校大學(xué)生無癥狀隱形眼鏡配戴者保存盒內(nèi)鏡片放置過夜的液體、40例未曾使用過的隱形眼鏡護(hù)理液、42例疑似棘阿米巴角膜炎患者眼分泌物及58例正常人眼分泌物。 結(jié)果： 1.三種不同基因型棘阿米巴肉眼觀察，

4、形態(tài)上沒有多大差異。但據(jù)延邊醫(yī)學(xué)院提供的基因序列，可知Acanthamoeba，sp.CJY/s株和CJY/s2株同屬T4基因型，A.castellaniiNeff屬于Neff型。Acanthamoebasp.CJY/s和Neff株具有99％相同堿基。Gram染色后，鏡下清晰可見包囊雙層囊壁結(jié)構(gòu)，亮圈狀。滋養(yǎng)體形態(tài)較難形容，但可以清楚看見其內(nèi)含的食物泡和細(xì)胞核。 2.PCR反映體系共30μl。其中含模板DNA5μl，引物(5μm

5、ol/L)2μl，Taq酶(1.5U/μl)0.3μl。反應(yīng)參數(shù)如下：94℃5min，94℃40s，復(fù)性溫度40s，72℃45s。共35個(gè)循環(huán)，最后72℃5min。由于引物不同，復(fù)性溫度值也不同。引物Q-1、JDP和FT對(duì)應(yīng)的復(fù)性溫度值分別為50℃、55℃和61℃，雙重PCR的復(fù)性溫度值為60℃。單一PCR擴(kuò)增三種棘阿米巴蟲株18SrDNA，JDP和Q-1引物均擴(kuò)增出分子量大小為463bp和188bp的特定擴(kuò)增帶。單一PCR擴(kuò)增三種棘阿

6、米巴蟲株26SrDNA，Acanthamoebasp.CJY/s2株和A.castellaniiNeff株的26S核糖體DNA基因片段擴(kuò)增出分子量大小為126bp的特定擴(kuò)增帶，而Acanthamoebasp.CJY/s株未得到預(yù)期的擴(kuò)增帶。雙重PCR同時(shí)擴(kuò)增三種不同基因型棘阿米巴、大腸桿菌、流感病毒的18SrDNA和26SrDNA基因。Acanthamoebasp.CJY/s2株和A.castellaniiNeff株中分別擴(kuò)增出分子量大

7、小為463bp和126bp的特定擴(kuò)增帶。而Acanthamoebasp.CJY/s株僅擴(kuò)增出分子量大小為463bp的特定擴(kuò)增帶。大腸桿菌和流感病毒未有擴(kuò)增出任何條帶，說明該檢測方法具有高特異性。PCR檢測棘阿米巴靈敏度為8個(gè)病原。 3.雙重PCR檢測兔子左眼分泌物、眼沖洗液、眼角膜刮片和眼活檢角膜組織提取的核酸中均擴(kuò)增出分子量大小為463bp和126bp的特定擴(kuò)增帶；右眼四種物質(zhì)均未擴(kuò)增出任何條帶。兔子角膜病理切片HE染色后鏡下

8、可見：兔子右眼(對(duì)照組)角膜組織結(jié)構(gòu)清楚，兔子左眼(實(shí)驗(yàn)組)上皮細(xì)胞層、前彈力層潰破，大量炎性細(xì)胞浸潤。上皮細(xì)胞層中看見棘阿米巴包囊，基質(zhì)層內(nèi)看見棘阿米巴滋養(yǎng)體。 4.雙重PCR檢測結(jié)果：83例隱形眼鏡保存盒內(nèi)液體，陽性1例，經(jīng)核實(shí)該病人曾經(jīng)患有棘阿米巴角膜炎，藥物治療后好轉(zhuǎn)；40例未曾使用過的隱形眼鏡護(hù)理液均為陰性；42例疑似病人眼分泌物，陽性2例，其中1人為隱形眼鏡配戴者，1人曾有角膜外傷史；58例正常人眼分泌物均為陰性。瓊

9、脂培養(yǎng)結(jié)果：123例隱形眼鏡保存盒內(nèi)液體均陰性；42例疑似病人眼分泌物，陽性2例，即為雙重PCR檢測陽性患者；58例正常人眼分泌物均為陰性。檢測是否感染棘阿米巴的“金標(biāo)準(zhǔn)”到目前為止是培養(yǎng)病原陽性。但結(jié)合病史，雙重PCR的陽性檢測率優(yōu)于金標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)論： 1.雙重PCR具有高特異性，敏感性，能夠有效的防止誤診。與單一的PCR擴(kuò)增相比，雙重PCR技術(shù)更好地防止了由于棘阿米巴屬的基因分型過多造成的漏診。 2.雙重PCR